橘油處理對(duì)柑橘果皮組織結(jié)構(gòu)物質(zhì)的影響

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

橘油處理對(duì)柑橘果皮組織結(jié)構(gòu)物質(zhì)的影響

許佳妮，崔文靜，鄧麗莉，曾凱芳*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

以果皮塌陷指數(shù)、變色指數(shù)以及與細(xì)胞膜、細(xì)胞壁相關(guān)的物質(zhì)為測(cè)定指標(biāo)，研究橘油處理致柑橘果實(shí)油胞病對(duì)果皮組織結(jié)構(gòu)物質(zhì)的影響。結(jié)果表明，橘油處理可引起柑橘油胞病的發(fā)生，病癥隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而加劇；橘油可促使果皮組織內(nèi)脂氧合酶活性和超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率增加，從而加速細(xì)胞膜降解，果皮組織電導(dǎo)率明顯上升、丙二醛含量迅速增加；橘油處理前期，果皮細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)木質(zhì)素、纖維素會(huì)迅速合成，果膠甲酯酶與多聚半乳糖醛酸的活性受到抑制，果皮細(xì)胞壁會(huì)有一定程度加厚。

柑橘；油胞病；橘油處理；細(xì)胞膜；細(xì)胞壁

柑橘是世界第一大水果，我國柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，2011年我國已超過巴西和美國，成為世界柑橘種植面積和產(chǎn)量均為世界第一的國家[1]。柑橘果實(shí)具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，色香味兼優(yōu)，廣受消費(fèi)者青睞[2]。然而，采后柑橘在不同貯藏環(huán)境因子的共同作用下，生理代謝易發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致采后病害的發(fā)生，加速果實(shí)衰老和品質(zhì)劣變[3-4]。目前，柑橘果實(shí)病害研究集中在其侵染性病害的發(fā)生機(jī)制和控制措施方面，而對(duì)果實(shí)生理性病害研究較少[5-6]。

油胞病是柑橘果實(shí)常見的一種生理性病害，發(fā)病初期果皮出現(xiàn)形狀不規(guī)則的淺綠色或淡黃色病斑，病斑內(nèi)油胞突出，油胞周圍組織稍凹陷；此后隨病癥加重，病害區(qū)果皮下沉且病斑顏色加深至深褐色，油胞塌陷萎縮[7-8]。油胞病病變部位一般僅在柑橘外果皮組織中，內(nèi)果皮組織無明顯病狀，對(duì)果實(shí)食用品質(zhì)無太大影響；然而病變部位易受病原菌如青霉、綠霉、炭疽菌等入侵，從而導(dǎo)致果實(shí)腐爛[9]。關(guān)于柑橘果皮油胞病害發(fā)生的原因，有研究[10-13]認(rèn)為是由于柑橘果皮在各種不利外部因素如光照、溫度、濕度、氣體成分以及機(jī)械損傷的影響下受損，導(dǎo)致油胞釋放具有光毒性的橘油而引起相應(yīng)的生理病癥。然而，目前柑橘果皮油胞病的發(fā)病機(jī)制還存在很大爭(zhēng)議，油胞病的發(fā)病實(shí)質(zhì)仍是一個(gè)懸而未解的難題。因此，本實(shí)驗(yàn)采用橘油處理臍橙果實(shí)，一方面為橘油傷害可能是果實(shí)油胞病發(fā)病的根本原因補(bǔ)充研究基礎(chǔ)；另一方面通過橘油快速誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生油胞病，分析油胞病發(fā)病果實(shí)果皮組織細(xì)胞膜、細(xì)胞壁相關(guān)結(jié)構(gòu)物質(zhì)變化，從而進(jìn)一步探討油胞病發(fā)病的機(jī)理機(jī)制，為柑橘果實(shí)油胞病的預(yù)防與控制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

供試柑橘（Citrus sinensisL.Osbeck），產(chǎn)地為重慶北碚區(qū)，挑選飽滿、色澤光亮呈黃色、大小均一、成熟度一致的新鮮成熟果實(shí)，剔除病、傷果；柑橘精油（純度為100%） 植優(yōu)雅香精油公司。

1.2方法

1.2.1橘油處理

參照Wild[14]、劉麗丹[15]等的處理方法并做一定修正。剪切寬為1.0 cm的濾紙條吸附在透明膠帶上，每隔2 cm滴上15μL100%純度的柑橘精油，最后將膠帶沿臍橙果實(shí)赤道部位纏繞一圈。用0.015 mm厚的聚乙烯袋單果包裝處理后的臍橙果實(shí)，于5℃條件下貯藏3 d；拆除膠帶，再用聚乙烯袋單果包裝果實(shí)后置于相應(yīng)的溫度（5℃）條件下貯藏8 d。對(duì)照組為剛采摘、擦凈并晾干后的果實(shí)，用厚度為0.015 mm的聚乙烯袋單果包裝，于5℃、相對(duì)濕度為85%的條件下貯藏，周期為11 d。果實(shí)分別于貯藏期間第0、1、3、5、7、11天進(jìn)行觀察并取樣測(cè)定；觀察組每組8個(gè)果實(shí)，3次重復(fù)；取樣組每次取樣每處理8個(gè)果實(shí)，3次重復(fù)，以鋒利的不銹鋼刀切取果實(shí)赤道部位果皮，置于-18℃保存，用于測(cè)定。

1.2.2塌陷指數(shù)和褐變指數(shù)的測(cè)定

參照Knight等[16]的評(píng)定方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，果皮塌陷指數(shù)和變色指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1，計(jì)算見式（1）、（2）。

表1 果皮塌陷指數(shù)和變色指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation criteria for collapse and discoloration of citrus peel

1.2.3指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1電導(dǎo)率和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測(cè)定

參照曹建康[17]、王國澤[18]、Hodges[19]等的方法并加以改進(jìn)。

1.2.3.2超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率的測(cè)定

參照王愛國等[20]的方法并加以改進(jìn)。

1.2.3.3脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活性的測(cè)定

參照陳昆松等[21]的方法，以每分鐘每克鮮樣酶促反應(yīng)體系234 nm波長(zhǎng)處吸光度增加0.01為1個(gè)LOX活性單位（U）。

1.2.3.4原果膠和可溶性果膠含量的測(cè)定

參照Manganaris等[22]的方法并加以改進(jìn)，以每克鮮樣中生成的半乳糖醛酸含量（%）作為原果膠或可溶性果膠的含量。

1.2.3.5果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）和多聚半乳糖醛酸（polygalacturonase，PG）活性的測(cè)定

參照Riov[23]、羅自生[24]等的方法，以30 min內(nèi)釋放出1 mmol的CH3O—為一個(gè)PME活性單位（U），以每小時(shí)每克鮮樣37℃時(shí)分解果膠產(chǎn)生1 mg半乳糖醛酸為一個(gè)PG活性單位（U）。

1.2.3.6木質(zhì)素和纖維素含量的測(cè)定

參照Morrison等[25]的方法并作修改，以每克鮮樣在280 nm波長(zhǎng)處的吸光度表示木質(zhì)素含量。纖維素含量測(cè)定參照牛森[26]的測(cè)定方法，在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的纖維素含量；結(jié)果為所查相應(yīng)纖維素含量與樣品質(zhì)量的比值。

1.2.3.7苯丙氨酸解氨酸（phenylalanine ammonialyase，PAL）和纖維素酶（cellulase，Cx）活性的測(cè)定

參照Luo Yang等[6]的方法，以每小時(shí)每克鮮樣酶促反應(yīng)體系290 nm波長(zhǎng)處吸光度增加0.01為1個(gè)PAL活性單位（U）。參照Gorhamann等[27]的方法并作修改，以每小時(shí)每克鮮樣37℃時(shí)產(chǎn)生1μg葡萄糖為一個(gè)Cx活性單位（U）。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖形分析

采用Excel 2003統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤并制圖；應(yīng)用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用t檢驗(yàn)對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1橘油處理對(duì)柑橘果皮塌陷指數(shù)和變色指數(shù)的影響

如圖1所示，橘油處理組和對(duì)照組果皮病斑塌陷指數(shù)隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而增加，其第11天塌陷指數(shù)分別為第1天的3.10、3.81倍。橘油處理組病斑塌陷指數(shù)一直高于對(duì)照組，其在第1天和第11天塌陷指數(shù)分別是對(duì)照組的1.66倍和1.34倍。

橘油處理組和對(duì)照組果皮病斑變色指數(shù)隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而增加，其第11天變色指數(shù)分別為第1天的5.50倍和2.31倍。橘油處理組病斑變色指數(shù)一直高于對(duì)照組，其變色指數(shù)在第3天迅速增加，其在第1、3、11天變色指數(shù)分別是對(duì)照組的1.50、2.88、3.57倍。

圖1 橘油處理對(duì)臍橙果皮塌陷指數(shù)（A）和變色指數(shù)（B）的影響Fig.1 Effect of oil treatment on collapse index (A) and discoloration index (B) of Navel orange peel

2.2橘油處理對(duì)柑橘果皮膜脂過氧化的影響

如圖2A所 示，橘油處理組和對(duì)照組LOX活性均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。對(duì)照組在第1天活性迅速上升并達(dá)峰值，隨后其活性緩慢下降并保持在較低水平。貯藏至第3天，橘油處理組LOX活性達(dá)到峰值，為對(duì)照的1.6倍（P＜0.05），表明經(jīng)橘油處理會(huì)刺激果實(shí)LOX活性增加；但橘油處理在后期對(duì)LOX活性影響較小，第7天后其LOX活性均低于對(duì)照組。

圖2 橘油處理對(duì)臍橙果皮LOX活性（A）、超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率（B）、MDA含量（C）和相對(duì)電導(dǎo)率（D）的影響Fig.2 Effect of oil treatment on LOX activity (A), superoxide anion production rate (B), MDA content (C), and cell membrane permeability (D) in Navel orange peel

如圖2B所示，橘油處理組超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率一直處于較高水平，與對(duì)照組均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，但始終高于對(duì)照組。處理組和對(duì)照組超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率均于第3天達(dá)到峰值，此時(shí)處理組是對(duì)照組的1.15倍（P＜0.05），隨后各組速率均下降但橘油處理組下降趨勢(shì)較對(duì)照組小。

如圖2C所示，橘油處理組和對(duì)照組MDA含量總體呈上升趨勢(shì)，除第7天外橘油處理組MDA含量均高于對(duì)照組。橘油處理組MDA含量在第1天迅速增加且保持在較高水平，貯藏第11天MDA值達(dá)到峰值，為對(duì)照組的1.18倍（P＜0.05）。

如圖2D所示，橘油處理組和對(duì)照組相對(duì)電導(dǎo)率總體呈上升趨勢(shì)，橘油處理組相對(duì)電導(dǎo)率一直高于對(duì)照組。橘油處理組電導(dǎo)率從第5天開始上升趨勢(shì)明顯大于對(duì)照組，在第11天達(dá)到峰值時(shí)，處理組相對(duì)電導(dǎo)率是對(duì)照組的1.36倍（P＜0.05）。

2.3橘油處理對(duì)柑橘果皮細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)的影響

2.3.1對(duì)原果膠含量、可溶性果膠含量、PME活性和PG活性的影響

圖3 橘油處理對(duì)臍橙果皮原果膠含量（A）、可溶性果膠含量（B）、PME活性（C）、PG活性（D）的影響Fig.3 Effects of oil treatment on protopectin content (A), water-soluble pectin content (B), PME activity (C) and PG activity (D) in Navel orange peel

如圖3A、B所示，橘油處理組和對(duì)照組原果膠含量均呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì)；處理組原果膠含量總體下降程度較對(duì)照組小，其一直保持在較高水平且始終高于對(duì)照組。橘油處理組在第11天原果膠含量是對(duì)照組的2.10倍（P＜0.01）。橘油處理組和對(duì)照組可溶性果膠含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)；但各組可溶性果膠含量峰值出現(xiàn)時(shí)間不同，對(duì)照組可溶性果膠含量在第7天迅速增加并達(dá)到峰值；橘油處理組可溶性果膠含量在第5天迅速增加并在第9天達(dá)到峰值，隨后其含量迅速下降。

如圖3C、D所示，對(duì)照組PME活性總體呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)。橘油處理組PME活性在貯藏前7 d一直低于對(duì)照組，變化較平緩，第9天急劇升高并達(dá)到峰值，其活性為對(duì)照的1.97倍（P＜0.01），此后PME活性急劇下降到最低水平。由此說明，橘油在貯藏前期抑制PME活性，但后期PME活性急劇升高。橘油處理組和對(duì)照組PG活性變化趨勢(shì)基本一致，其活性在貯藏前7 d均波動(dòng)較大，均在第5天急劇升高達(dá)到峰值后迅速下降，隨后維持在一定的酶活水平。

2.3.2對(duì)木質(zhì)素含量、纖維素含量、PAL活性和Cx活性的影響

圖4 橘油處理對(duì)臍橙果皮木質(zhì)素含量（A）、 纖維素含量（B）、PAL活性（C）、Cx活性（D）的影響Fig.4 Effects of oil treatment on lignin content (A), cellulose content (B), PAL activity (C) and Cx activity (D) in Navel orange peel

如圖4A、B所示，橘油處理組和對(duì)照組木質(zhì)素含量呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，但至貯藏末期，各組木質(zhì)素含量差異并不明顯（P＞0.05）。橘油處理組木質(zhì)素含量在第3天達(dá)到峰值，為對(duì)照組的1.47倍（P＜0.05）；表明橘油處理可以在貯藏前期誘導(dǎo)木質(zhì)素的 大量合成。橘油處理組和對(duì)照組纖維素含量呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)；但貯藏末期各組纖維素含量無明顯差異（P＞0.05）。橘油處理組纖維素含量在第3天急劇增加并達(dá)到最大值，其含量是對(duì)照組的3.06倍（P＜0.01），隨后其纖維素含量于第7天急劇下降；表明橘油處理可以在貯藏前中期誘導(dǎo)纖維素的大量合成。

如圖4C、D所示，對(duì)照組PAL活性總體呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。橘油處理組在PAL活性呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，其活性在第3天急劇增加并達(dá)到峰值，是對(duì)照組的2.31倍（P＜0.01），隨后PAL活性急劇下降并維持在較低水平上。橘油處理組和對(duì)照組Cx活性總體上呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但處理組酶活性峰值出現(xiàn)較晚。橘油處理組和對(duì)照組在0～5 d內(nèi)Cx活性基本保持較低水平；對(duì)照組Cx活性在第7天迅速增加并達(dá)到峰值，橘油處理組Cx活性第9天急劇增加并達(dá)到峰值，其活性為對(duì)照的1.67倍（P＜0.01）。

3 討 論

采后柑橘果實(shí)經(jīng)橘油處理后，果皮出現(xiàn)塌陷與變色癥狀，其癥狀隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而加重，與油胞病的典型特征一致，也與大多數(shù)研究結(jié)果[16,28-29]類似。本實(shí)驗(yàn)采用外源涂抹橘油的方式誘導(dǎo)油胞病發(fā)生，為油胞病的發(fā)生機(jī)制，即油胞病的發(fā)生很可能與柑橘果皮中的橘油密切相關(guān)，提供了理論依據(jù)。

油胞病的發(fā)生可引起果皮細(xì)胞代謝紊亂，對(duì)果皮組織如細(xì)胞膜和細(xì)胞壁造成影響[30]。有研究報(bào)道，細(xì)胞膜的降解和過氧化是在磷脂酶、LOX和活性氧的共同作用下發(fā)生的，從而引起細(xì)胞膜通透性改變，組織電導(dǎo)率發(fā)生明顯變化；MDA是細(xì)胞膜的降解產(chǎn)物，可用來衡量細(xì)胞膜破損的程度[31-32]。本實(shí)驗(yàn)表明，橘油處理誘導(dǎo)油胞病可提高果皮組織內(nèi)LOX活性，激起活性氧爆發(fā)；處理組較高的超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率加速細(xì)胞膜降解，貯藏后期組織電導(dǎo)率維持在較高水平，MDA含量大量增加。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)組分的變化表明油胞病發(fā)病期間細(xì)胞膜完整性受到嚴(yán)重破壞，這與劉麗丹[15]關(guān)于油胞病果實(shí)抗氧化酶系統(tǒng)變化的研究結(jié)果相似，也與油胞病果實(shí)超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果一致：Knight等[16]用橘油誘導(dǎo)油胞病，30 min后觀察到在果皮組織皮層細(xì)胞中細(xì)胞膜出現(xiàn)輕微破損，病害后期則幾乎難以觀察到細(xì)胞膜存在。果皮細(xì)胞膜的降解是對(duì)油胞病的反饋，膜脂過氧化導(dǎo)致的細(xì)胞膜受損可能為橘油毒害細(xì)胞器提供途徑，細(xì)胞器如葉綠體的損傷將導(dǎo)致果實(shí)病斑部位的褐變。

細(xì)胞壁的主要成分是果膠、木質(zhì)素和纖維素等大分子物質(zhì)。在PME的水解作用下原果膠被分解為可溶性果膠，可溶性果膠進(jìn)而在PG作用下被分解為葡萄糖，從而引起細(xì)胞壁水解；木質(zhì)素是復(fù)雜的苯丙烷單體聚合物，它的合成經(jīng)過苯丙氨酸途徑進(jìn)行，受該代謝途徑關(guān)鍵酶PAL調(diào)控，是木質(zhì)組織的重要成分，可增加細(xì)胞壁的厚度和韌性；纖維素是細(xì)胞壁的骨架物質(zhì)，是外層初生壁和內(nèi)層次生壁的主要成分，它的降解意味著細(xì)胞壁的解體和果實(shí)的軟化[33-35]。在本實(shí)驗(yàn)中，橘油處理前期可抑制PME活性，從而使原果膠含量保持在較高水平，而其可溶性果膠含量峰值也有所延遲。橘油處理組在第3天PAL活性和木質(zhì)素含量均達(dá)到峰值；橘油處理前期可提高PAL活性，從而誘導(dǎo)組織內(nèi)木質(zhì)素大量合成，使細(xì)胞壁韌性變強(qiáng)。處理組Cx在貯藏前中期活性保持在較低水平，峰值出現(xiàn)時(shí)間較對(duì)照組晚，這與處理組貯藏前中期較高的纖維素含量相符。因此，在油胞病發(fā)病初期，果皮細(xì)胞壁會(huì)因纖維素和木質(zhì)素的大量合成以及原果膠降解受抑制而加厚，在外觀上表現(xiàn)為病斑變硬的癥狀；這與Knight[16]、Shormer[7]等通過透射電鏡觀察到的油胞病發(fā)病后果皮組織和外表皮層細(xì)胞壁折疊加厚的現(xiàn)象一致。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，PE、PG和Cx活性的增強(qiáng)以及PAL活性的降低將使果皮結(jié)構(gòu)物質(zhì)包括原果膠、纖維素發(fā)生降解，從而在外觀上表現(xiàn)為病斑下陷的癥狀，果實(shí)果皮最終呈現(xiàn)軟化現(xiàn)象。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，橘油可導(dǎo)致柑橘果實(shí)油胞病的發(fā)生，致使果皮細(xì)胞膜和細(xì)胞壁組分發(fā)生變化，橘油致柑橘果皮劣變機(jī)制的進(jìn)一步明確為研究采后柑橘果實(shí)油胞病變提供了理論依據(jù)。然而，關(guān)于如何消除橘油對(duì)果皮的負(fù)面影響需要后續(xù)更深入的研究；若能從橘油作用的角度入手，探索一種有效防止橘油損傷果皮組織細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的措施，將為油胞病的控制提供新的、更加可行的思路和方法。

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Effects of Orange Oil Treatment on Structural Materials of Orange Peel Tissue

XU Jiani, CUI Wenjing, DENG Lili, ZENG Kaifang*
(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

The effects of oleocellosis induced by orange oil on the structural materials of Navel orange peel tissue were studied based on collapse index, color index, cell membrane and cell wall-related index. Results showed that the oil treatment could induce oleocellosis on Navel orange and the disease was more notable as the storage time was prolonged. Orange oil could result in a rise in lipoxygenase (LOX) activity and superoxide anion production rate of peel tissue, in turn accelerating the degradation of the cell membrane, increasing dramatically the cell membrane permeability and the content of malondialdehyde (MDA). During the early storage period, the contents of cell wall-related materials such as lignin and cellulose of the oil-treated peel tissue increased quickly and the activities of pectin methylesterase (PME) and polygalacturonase (PG) were inhibited. Thus, the cell wall could be thickened to some degree. This study can provide a theoretical reference for exploring the mechanisms and control strategies of oleocellosis.

citrus; oleocellosis; oil treatment; cell membrane; cell wall

S609.3；S667.7

A

1002-6630（2015）12-0237-06

10.7506/spkx1002-6630-201512045

2014-11-27

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471631）；重慶市科技攻關(guān)（應(yīng)用技術(shù)研發(fā)類/重點(diǎn)）項(xiàng)目（cstc2012gg-yyjsB80003）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203034）；重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心能力提升項(xiàng)目（cstc2014pt-gc8001）

許佳妮（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：xujiani199008@163.com

*通信作者：曾凱芳（1972—），女，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。E-mail：zengkaifang@163.com