紫薯中綠原酸類化合物標準品的制備

李 甫，陳 斌，李聯洪，王明奎

（1.中國科學院成都生物研究所，四川 成都 610041；2.成都曼思特生物科技有限公司，四川 成都 610000）

紫薯中綠原酸類化合物標準品的制備

李 甫1，陳 斌1，李聯洪2，王明奎1

（1.中國科學院成都生物研究所，四川 成都 610041；2.成都曼思特生物科技有限公司，四川 成都 610000）

從紫薯中提取制備高純度、市場價值較高的綠原酸類化合物標準品。紫薯切片，采用沸水提取、大孔樹脂吸附和凝膠柱色譜分段，然后以反相制備液相色譜獲得高純標準品，最后以核磁共振技術確定化學結構。從紫薯中制備得到異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和3,4,5-O-三咖啡酰基奎寧酸，高效液相色譜檢測表明這些化合物的純度均在98%以上。本研究建立的制備工藝可高效地將紫薯中綠原酸類化合物富集，并快速獲得高純樣品，有效地避免了紫薯花色苷類化合物對產品色澤和純度的影響。

紫薯；綠原酸類化合物；標準品；分離；制備

紫薯（Ipomoea batatas L.）為旋花科甘薯屬草本植物，一般認為其原產于熱帶美洲或中美洲，世界上許多熱帶或亞熱帶地區都有廣泛種植。在一些發展中國家，紫薯已經成為一種主要的糧食作物。就世界范圍而言，紫薯已成為小麥、水稻、玉米、馬鈴薯、大麥和木薯之后排名第七的主食[1]。研究表明，紫薯含有多種功能性成分，如花青素[2-7]、咖啡酸類化合物[8-10]、黃酮[11]、多糖[12]、游離氨基酸[13]、有機硒[14]和蛋白質等[15]，因此，紫薯具有多種生理保健功能，如抗癌[16-17]、降血糖[18-19]、降血壓[20]、抗氧化[21-22]等。

紫薯中的綠原酸類化合物主要為咖啡酰基奎寧酸類化合物，這類化合物生物活性好，是許多中藥材（如金銀花）和相關藥品的主要活性成分，常被用來評價相關藥材和藥品質量的標準物質。然而，部分該類成分，如異綠原酸B、異綠原酸C和3,4,5-三咖啡酰基奎寧酸在傳統藥材中的含量較低，且結構不穩定，關于這些化合物標準品制備工藝鮮有報道。已有研究和筆者高效液相色譜分析結果表明，紫薯中這些化合物的含量較高，是大量獲得其高純樣品的優質資源[8]。但是，研究發現紫薯中的花青素類化合物在多數分離材料上拖尾現象非常嚴重，直接影響綠原酸類化合物最終產品的色澤和純度。有文獻報道采用高速逆流色譜技術從紫薯中分離得到綠原酸和異綠原酸A，但是這兩個化合物在山銀花等藥材中含量同樣較高，市場價值不大，且異綠原酸A的純度尚未達到標準品的要求，其對最終產品的色澤也沒有明確說明[23]。為此，本實驗研究從紫薯中獲取色澤較好、純度大于98%的一系列綠原酸類成分的生產工藝。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

紫薯KX-3 四川紫金都市農業發展有限公司。

乙腈（色譜純） 美國Sigma公司；異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、3,4,5-三咖啡酰基奎寧酸標準品 成都曼思特生物科技公司；D72大孔樹脂天津波鴻樹脂科技有限公司；Sephadex LH-20凝膠北京綠百草科技發展有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

LC-20AT液相色譜分析儀（配有自動進樣器和DAD檢測器） 日本島津公司；LC-6000型制備高效液相色譜儀 北京創新通恒科技有限公司；Ascend 400M核磁共振儀 瑞士Bruker公司。

1.3方法

1.3.1 色譜條件

分析色譜條件：分析型色譜柱：依利特Sinachrom ODS BP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；流速：0.8 mL/min；流動相：乙腈-水-醋酸（22∶73∶5，V/V）；進樣量：20 μL。

制備色譜條件：制備色譜柱：Daiso-ODS-BP（50 mm×250 mm，10 μm）；柱溫：室溫；檢測波長：280 nm；流速：80 mL/min；一次制備流動相：乙腈-水-醋酸（20∶75∶5，V/V）；二次制備流動相：乙腈-水-醋酸（18∶77∶5，V/V）。

1.3.2 制備色譜條件的建立

實驗考察了不同流動相組成對紫薯中綠原酸類化合物分離效果的影響，發現甲醇-酸水體系對該類化合物的分離度較差，重疊較為嚴重，而乙腈-酸水體系分離度較好，所以選擇乙腈-酸水體系作為制備溶液。

二極管陣列檢測器表明綠原酸類化合物的最大吸收波長為326 nm，花色苷類化合物的最大吸收波長為280 nm和530 nm，考慮到該組分主要為綠原酸類成分、花色苷類成分含量較低、制備液相檢測器靈敏度不高等因素，將制備液相波長設定為280 nm，以有效地檢測到微量的花色苷化合物，獲得高純度的綠原酸類化合物單體。

流速的確定取決于分離度、填料性能和泵的工作能力，綜合考慮這3方面因素，本實驗分別考察60、80、100 mL/min流速條件下的分離情況，確定流速80 mL/min最為合適。

1.3.3 紫薯綠原酸類化合物的提取與純化

紫薯（5 kg）切薄片，以沸水提取3 次（20 L/次），每次提取時間10 min，提取液過濾，濾液加濃鹽酸至pH 3，該溶液通過D72大孔樹脂，純水洗脫至洗脫液無色，換用甲醇洗脫至樹脂無色，甲醇洗脫液濃縮至干，得紅色洗脫物43 g。取20.0 g該洗脫物溶于50 mL 0.5%醋酸水溶液進行Sephadex LH-20柱層析，先用40%甲醇（含0.5%醋酸）溶液洗脫，色譜柱中呈現出3 條色帶，均為紫薯花色苷類化合物，依次接收得組分1～3，再以80%甲醇（含0.5%醋酸）溶液洗脫得紫薯綠原酸類化合物（組分4）。

1.3.4 紫薯綠原酸類化合物的制備

取2.0 g組分4溶于10 mL制備液中，過濾，采用1.3.1節制備液相條件的方法進行制備，根據峰形收集13～30 min流出液，60 ℃減壓濃縮干燥，得化合物1、化合物2、化合物3和化合物4。

1.3.5 純度檢測

以1.3.1節中的分析色譜方法進行純度測定，采用面積歸一化法進行計算。

1.3.6 結構鑒定

采用1H-NMR和13C-NMR技術對4 個化合物進行結構鑒定，化合物1、2和3用CD3OD溶解，化合物4用二甲基亞砜-d6溶解，核磁共振頻率400 MHz。

2 結果與分析

2.1 紫薯中綠原酸類化合物與花色苷類化合物的初級分離

紫薯的主要化學成分為花色苷和綠原酸類化合物，花色苷類化合物為紅色，綠原酸類成分為白色，因此，首先要實現兩者的有效分離，避免花色苷類化合物影響綠原酸類化合物的色澤和純度。通過實驗發現，花色苷類化合物在正相硅膠和反相硅膠上拖尾都非常嚴重，而且在這兩種分離材料上花色苷和綠原酸類似物分離度不好，重疊較為嚴重，這兩種分離材料并不適合兩者的初級分離。進一步實驗發現Sephadex LH-20凝膠柱對紫薯花色苷和綠原酸類化合物具有很好的分離度，而且花色苷類化合物在凝膠上幾乎沒有拖尾現象，色帶非常集中，因此選用Sephadex LH-20凝膠有效地實現兩者的分離。

在1.3.3節條件下，獲得3 個主要含有紫薯花色苷的組分1（1.4 g）、組分2（1.9 g）和組分3（8.2 g），同時獲得主要含有紫薯綠原酸類化合物的組分4（7.9 g）。

2.2 色譜峰的收集和樣品的高效液相色譜分析

一次制備時采用中心切割法對4 個色譜峰分別進行收集（圖1）。峰3和峰4的分離度較好，僅一次制備就可以獲得98%以上的純品；峰1和峰2有部分重疊，一次制備獲得產品純度不夠，需二次制備，二次制備時將流動相中的乙腈比例適當降低，延長峰1和峰2的保留時間，使兩者基本達到基線分離，獲得純度合格的標準樣品。

圖1 紫薯組分4制備液相色譜圖Fig.1 Preparative high performance liquid chromatography of fraction 4 from sweet purple potato

圖2 化合物1（a）、2（b）、3（c）、4（d）的高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatography of compounds 1 (a), 2 (b), 3 (c) and 4 (d)

在1.3.4節的分離制備條件下，從2.0 g組分4中分離得到化合物1（峰1）115.3 mg、化合物2（峰2）148.8 mg、化合物3（峰3）45.1 mg、化合物4（峰4）7.3 mg。采用面積歸一法計算這些化合物的純度依次為99.9%、 99.7%、99.9%和98.2%，均高于98.0%，符合標準品的要求（圖2）。

2.3結構鑒定

圖3 化合物1～4的化學結構Fig.3 Chemical structures of compounds 1 through 4

化合物1，白色粉末。1H-N M R（C D3O D，400 MHz）δ：5.62（1H，m，H-3）、5.12（1H，m，H-4）、4.39（1H，m，H-5）、2.31（1H，m，H-6）、2.21（2H，m，H-2）、2.12（1H，m，H-6）、7.58（1H，d，J=15.9 Hz，H-7’）、7.52（1H，d，J=15.9 Hz，H-7’）、7.02（H，d，J=1.8 Hz，H-2’,）、7.00（H，d，J=1.8 Hz，H-2’）、6.91（1H，d，J=8.0 Hz，H-6’）、6.89（1H，d，J=8.0 Hz，H-6’）、6.75（1H，d，J=8.0 Hz，H-5’）、6.73（1H，d，J=8.0 Hz，H-5’）、6.29（1H，d，J=15.9 Hz，H-8’）、6.18（1H，d，J=15.9 Hz，H-8’’）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：76.2（C-1）、39.4（C-2）、69.2（C-3）、75.8（C-4）、69.3（C-5）、38.7（C-6）、176.9（C-7）、127.9（C-1’）、127.6（C-1’）、115.4（C-2’）、115.3（C-2’）、146.9（C-3’）、146.8（C-3’）、149.6（C-4’，4’）、116.6（C-5’）、116.5（C-5’）、123.2（C-6’）、1 2 3.1（C-6’’）、1 4 7.9（C-7’）、147.8（C-7’）、114.8（C-8’，8’）、168.8（C-9’）、168.3（C-9’）。以上數據與文獻[24]報道的3,4-O-雙咖啡酰基-奎寧酸的核磁數據基本一致，故鑒定化合物1為3,4-O-雙咖啡酰基-奎寧酸，即異綠原酸B（結構見圖3）。

化合物2，白色粉末。1H-N M R（C D3O D，400 MHz）δ：5.42（1H，m，H-5）、5.39（1H，m，H-3）、3.96（1H，m，H-4）、2.30（1H，m，H-6）、2.17（2H，m，H-2）、2.15（1H，m，H-6）、7.60（1H，d，J=15.9 Hz，H-7’）、7.56（1H，d，J=15.9 Hz，H-7’）、7.06（2H，brs，H-2’，2’’）、6.94（1H，d，J=8.0 Hz，H-6’）、6.96（1H，d，J=8.2 Hz，H-6’）、6.77（1H，d，J=8.0 Hz，H-5’）、6.79（1H，d，J=8.2 Hz，H-5’）、6.35（1H，d，J=15.9 Hz，H-8’）、6.26（1H，d，J=15.9 Hz，H-8’）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：74.9（C-1）、37.7（C-2）、72.2（C-3）、7 0.8（C-4）、7 2.7（C-5）、3 6.2（C-6）、177.5（C-7）、128.1（C-1’）、127.9（C-1’’）、115.5（C-2’）、115.3（C-2’）、147.4（C-3’）、147.0（C-3’）、149.7（C-4’）、149.6（C-4’）、116.6（C-5’）、116.6（C-5’）、123.2（C-6’）、123.0（C-6’）、147.2（C-7’）、147.0（C-7’）、115.7（C-8’）、115.1（C-8’）、169.1（C-9’）、168.5（C-9’）。以上數據與文獻[24]報道的3,5-O-雙咖啡酰基-奎寧酸的核磁數據基本一致，故鑒定化合物1為3,5-O-雙咖啡酰基-奎寧酸，即異綠原酸A（結構見圖3）。

化合物3，白色粉末。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δ：5.42（1H，dd，J=8.2，3.2 Hz，H-5）、5.32（1H，m，H-4）、3.97（1H，m，H-3）、2.36（1H，m，H-6）、2.21（2H，m，H-2）、2.14（1H，m，H-6）、7.62（1H，d，J=15.9 Hz，H-7’）、7.56（1H，d，J=16.0 Hz，H-7’）、7.06（2H，d，J=2.0 Hz，H-2’，H-2’）、6.97（2H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6’，6’）、6.79（1H，d，J=8.0 Hz，H-5’）、6.77（1H，d，J=8.0 Hz，H-5’）、6.35（1H，d，J=15.9 Hz，H-8’）、6.21（1H，d，J=16.0 Hz，H-8’’）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：74.1（C-1）、37.3（C-2）、69.5（C-3）、73.6（C-4）、72.1（C-5）、36.9（C-6）、176.8（C-7）、127.9（C-1’）、127.8（C-1’）、115.6（C-2’）、115.2（C-2’）、146.7（C-3’）、146.8（C-3’）、149.5（C-4’，4’）、116.6（C-5’）、116.5（C-5’）、123.1（C-6’）、123.0（C-6’）、147.0（C-7’）、146.9（C-7’）、115.0（C-8’）、114.8（C-8’）、169.3（C-9’）、168.5（C-9’）。以上數據與文獻[25]報道的4,5-O-雙咖啡酰基-奎寧酸的核磁數據基本一致，故鑒定化合物1為4,5-O-雙咖啡酰基-奎寧酸，即異綠原酸C（結構見圖3）。

化合物4，白色粉末。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：5.38（2H，m，H-3，5）、5.28（1H，m，H-4）、2.17（1H，m，H-6）、2.06（2H，m，H-2）、1.93（1H，m，H-6）、7.50（2H，d，J = 16.0 Hz，H-7’，7’’）、7.33（1H，d，J = 15.9 Hz，H-7’）、7.19（1H，d，J = 1.8 Hz，H-2’）、7.13（2H，d，J = 1.8 Hz，H-2’，2’’）、6.94（3H，m，H-6’，6’，6’’）、6.88（1H，d，J = 8.0 Hz，H-5’）、6.75（2H，d，J = 8.0 Hz，H-5’，5’’）、6.38（2H，d，J = 16.0 Hz，H-8’，8’’）、6.26（1H，d，J = 15.9 Hz，H-8’）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：72.9（C-1）、35.7（C-2）、67.4（C-3）、70.5（C-4）、68.0（C-5）、36.6（C-6）、174.2（C-7）、125.4（C-1’，1’’）、125.3（C-1’）、114.8（C-2’）、114.5（C-2’，2’’）、145.0（C-3’）、144.8（C-3’）、144.6（C-3’’）、145.8（C-4’）、145.6（C-4’）、145.5（C-4’’）、115.3（C-5’，5’，5’’）、122.2（C-6’）、121.0（C-6’，6’’）、148.5（C-7’）、148.4（C-7’，7’）、113.9（C-8’）、113.8（C-8’，8’’）、165.8（C-9’）、165.7（C-9’）、165.4（C-9’’）。以上數據與文獻[26]報道的3,4,5-O-三咖啡酰基奎寧酸的核磁數據基本一致，故鑒定化合物1為3,4,5-O-三咖啡酰基奎寧酸（結構見圖3）。

3 結 論

本實驗得出Sephadex LH-20凝膠可有效地實現紫薯中花色苷和綠原酸類化合物的分離，消除紫薯花色苷對綠原酸類成分色澤和純度的影響，進一步采用反相制備色譜快速、高效地獲得純度高于98.0%的異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和3,4,5-O-三咖啡酰基奎寧酸。這些化學成分均具有廣泛的的生理活性，科研、工業需求高，然而除了異綠原酸A外，其他幾種物質在傳統中藥材中雖有分布但普遍含量較低，因此市場價值較高。從本實驗的結果可以看出，異綠原酸B和異綠原酸C在紫薯中含量較高，是大量獲取這兩種成分的理想原料。本研究建立的制備工藝具有產品色澤好、純度高、操作簡單、成本低、可用于規模化生產等優點。

[1] MONTILLA E C, HILLEBRAND S, BUTSCHBACH D, et al. Preparative isolation of anthocyanins from Japanese purple sweet potato (Ipomoea batatasL.) varieties by high-speed countercurrent chromatography[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(18): 9899-9904.

[2] TERAHARA N, SHIMIZU T, KATO Y, et al. Six diacylated anthocyanins from the storage roots of purple sweet potato, ipomoea batatas[J]. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 1999, 63(8): 1420-1424.

[3] GODA Y, SHIMIZU T, KATO Y, et al. Two acylated anthocyanins from purple sweet potato[J]. Phytochemistry, 1997, 44(1): 183-186.

[4] 余燕影, 王杉, 曹樹穩, 等. 川山紫薯色素提取分離及主要組成成分分析[J]. 食品科學, 2004, 25(11): 167-170.

[5] 劉超, 王征, 李鑫, 等. 高效液相色譜法分析不同品種紫甘薯中花青素組分及其含量[J]. 中國食物與營養, 2008, 14(8): 19-21.

[6] 楊穎, 夏其樂, 陳劍兵, 等. 紫薯花色苷的理化性質研究[J]. 食品添加劑, 2009, 30(11): 251-253.

[7] 呂昱, 嚴敏. 紫薯花色苷的生理功能及分離純化研究進展[J]. 食品與機械, 2013, 29(4): 250-253.

[8] ISLAM M S, YOSHIMOTO M, YAHARA S, et al. Identifi cation and characterization of foliar polyphenolic composition in sweetpotato (Ipomoea batatas L.) genotypes[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(13): 3718-3722.

[9] HE Kai, YE Xiaoli, LI Xuegang, et al. Separation of two constituents from purple sweet potato by combination of silica gel column and high-speed counter-current chromatography[J]. Journal of Chromatography B, 2012, 881/882: 49-54.

[10] 丁利慶, 杜琪珍. 紫薯中兩種功能性成分的分離鑒定[J]. 食品科學, 2011, 32(1): 74-77.

[11] 陸國權, 任韻, 唐忠厚, 等. 甘薯黃酮類物質的提取及其基因型差異研究[J]. 浙江大學學報: 農業與生命科學版, 2005, 31(5): 541-544.

[12] 林娟, 邱宏端, 林宵, 等. 甘薯多糖的提取純化及成分分析[J]. 中國糧油學報, 2003, 18(2): 64-66.

[13] 眀興加, 李坤培, 張明, 等. 紫色甘薯的開發前景[J]. 重慶中草藥研究, 2006(1): 55-60.

[14] 劉宜貴, 吳松青. 美國超短蔓黑紅薯新品種[J]. 北京農業, 2002(12): 38.

[15] 劉魯林, 木泰華, 孫艷麗. 甘薯塊根中胰蛋白酶抑制劑研究進展[J].糧食與油質, 2006(12): 64-66.

[16] 劉寧, 王紅兵, 王春波. 青紫薯色素抗腫瘤作用及毒理學實驗研究[J].衛生研究, 2008, 37(4): 489-491.

[17] HAQIWARA A, YOSHINO H, ICHIHARA T, et al. Prevention by natural food anthocyanins, purple sweet potato color and red cabbage color of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP)-associated colorectal carcinogenesis in rats initiated with 1, 2-dimethylhydrazine[J]. Journal of Toxicology Science, 2002, 27(1): 57-68.

[18] MATSUI Y, EBUCHI S, FUKUI K, et al. Anti-hyperglycemic effect of diacylated anthocyanin derived from Ipomoea batatas cultivar Ayamurasaki can be achieved through the α-glucosidase inhibitory action[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(25): 7244-7248.

[19] 劉主, 彭凌, 朱必鳳, 等. 甘薯糖蛋白SPG-1的分離純化及其降血糖作用研究[J]. 食品研究與開發, 2006, 27(11): 68-72.

[20] YAMAKAWA O, SUDA I, YOSHIMOTO M, et al. Development and utilization of sweet potato cultivars with high anthocyanin content[J]. Journal of Food and Food Ingredients, 1998, 178(1): 69-77.

[21] 孟祥軍, 初曉, 王風華, 等. 青紫薯色素對自然衰老大鼠體內抗氧化能力的影響[J]. 齊魯醫學雜志, 2005, 20(5): 394-399.

[22] 王杉, 鄧澤元, 曹樹穩, 等. 紫薯色素對老齡小鼠抗氧化功能的改善作用[J]. 營養學報, 2005, 27(3): 245-248.

[23] 石伯陽, 李佳銀, 周橋, 等. 紫甘薯中綠原酸及異綠原酸的高速逆流色譜分離[J]. 食品科學, 2013, 34(13): 87-90. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201313019.

[24] 滕榮偉, 周志宏, 王祖德, 等. 白花刺參中的咖啡酰基奎寧酸成分[J].波譜學雜志, 2002, 19(2): 167-174.

[25] 周淵, 周思祥, 姜勇, 等. 毛冬青葉的化學成分研究[J]. 中草藥, 2012, 43(8): 1479-1483.

[26] 盧張偉, 鄭軍, 汪豪, 等. 山牡荊樹干心材的化學成分[J]. 藥學與臨床研究, 2009, 17(4): 287-289.

Preparation of High-Purity Chlorogenic Acid Derivatives from Purple Sweet Potato

LI Fu1, CHEN Bin1, LI Lianhong2, WANG Mingkui1
(1. Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China; 2. Chengdu MUST Bio-technology Company Limited, Chengdu 610000, China)

The purpose of the present study was to prepare high-purity and high-value chlorogenic acid derivatives from purple sweet potato. Purple sweet potato slices were extracted with hot water. The extracted compounds were separated with D72 macroporous resin, sephadex LH-20 column chromatography and preparative high performance liquid chromatography (HPLC) to obtain high-purity chlorogenic acid analogues which were identifi ed as isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid B, isochlorogenic acid C and 3,4,5-O-tricaffeoyl quinic acid, respectively, by nuclear magnetic resonance technique. HPLC analysis suggested that the purities of these analogues were all over 98%. The developed method can be used to rapidly obtain standard samples of chlorogenic acid derivatives from purple sweet potato, while avoiding effectively the negative effects of the anthocyanins on product color and purity.

purple sweet potato; chlorogenic acid derivative; standard sample; isolation; preparation

R284.2

A

1002-6630（2015）12-0133-05

10.7506/spkx1002-6630-201512025

2014-11-20

四川省科技支撐計劃項目（2012SZ0054）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAC09B04）

李甫（1979—），男，副研究員，博士，研究方向為天然產物化學。E-mail：lifu@cib.ac.cn