離子色譜法-積分安培檢測(cè)器測(cè)定葡萄酒中的天然糖

馬甲民，崔 鶴*，張文皓，李 立，董麗臻，李慧新

（1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島 266001；2.青島大學(xué)，山東 青島 266071；3.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123）

離子色譜法-積分安培檢測(cè)器測(cè)定葡萄酒中的天然糖

馬甲民1,2，崔 鶴1,*，張文皓1，李 立3，董麗臻1，李慧新1

（1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島 266001；2.青島大學(xué)，山東 青島 266071；3.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123）

建立測(cè)定葡萄酒中常見(jiàn)的8種天然糖（阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、果糖、L-山梨糖、蔗糖、異麥芽酮糖和麥芽糖）的離子色譜分析方法。以淋洗液發(fā)生器電解產(chǎn)生的KOH溶液梯度淋洗，在CarboPac PA20高效陰離子交換柱上，8種天然糖可以在30 min內(nèi)完成分離。使用積分安培檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，8種糖的檢出限（進(jìn)樣量10μL，RSN=3）分別為0.007、0.004、0.005、0.005、0.003、0.014、0.016 mg/L和0.020 mg/L，且均具有較寬的線性范圍（0.06～30 mg/L）。樣品測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.9%～8.7%之間，8種糖的加標(biāo)回收率在81.5%～95.1%之間；本方法檢測(cè)糖簡(jiǎn)便快捷、分離效果好、無(wú)需衍生、靈敏度高，適用于葡萄酒中的8種常見(jiàn)天然糖組分的分析。

離子色譜；積分安培檢測(cè)器；葡萄酒；天然糖

自然界中，天然糖種類(lèi)繁多，已發(fā)現(xiàn)的單糖主要是戊糖和己糖。天然存在的游離態(tài)和具有機(jī)能的二糖以哺乳類(lèi)的乳糖、細(xì)菌和昆蟲(chóng)血液等的海藻糖、植物的蔗糖、麥芽糖等為代表。這些是作為各種生物體的能量來(lái)源，或者作為生物體組成的物質(zhì)原料，承擔(dān)著所必需的糖類(lèi)的貯藏或運(yùn)輸?shù)闹匾饔谩Ｆ咸丫浦械奶欠N類(lèi)、含量對(duì)酒的風(fēng)味有較大的影響[1]。從葡萄酒行業(yè)內(nèi)的信息看出在釀造過(guò)程中加入某些糖類(lèi)對(duì)提高香氣復(fù)雜性、濃郁度有很好的幫助[2-3]。根據(jù)GB 2760—2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，規(guī)定異麥芽酮糖為甜味劑，按生產(chǎn)需要適量使用[4]。對(duì)照國(guó)外食品添加劑要求，D-木糖、L-阿拉伯糖和L-山梨糖未列入GB 2760—2011，也沒(méi)有限量要求[5-6]。因此，對(duì)各國(guó)進(jìn)口葡萄酒進(jìn)行本底調(diào)查，測(cè)定葡萄酒中天然糖的種類(lèi)、含量的信息顯得尤為必要。

由于食品基質(zhì)比較復(fù)雜，樣品前處理較為繁瑣，食品中天然糖的測(cè)定比較困難[7]。葡萄酒中天然單糖和二糖的測(cè)定研究不是很多，目前常見(jiàn)的食品中糖測(cè)定方法有化學(xué)法（比色法、滴定法）[8-9]、液相色譜串聯(lián)光檢測(cè)器法[10-11]、離子色譜法[12-13]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-16]、離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[17-18]、酶催化-電化學(xué)法[19]等。電位滴定法方法簡(jiǎn)單、成本較低、操作簡(jiǎn)便，可以直接測(cè)定出葡萄酒中的還原糖總量，但是不能分別測(cè)定出各種糖的含量[9]；液相色譜或離子色譜與質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)食品中糖的測(cè)定具有方法簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，并且可以同時(shí)對(duì)糖定性定量分析，但是其前處理較為繁瑣，所用質(zhì)譜儀器設(shè)備成本較高[14-18]；高效液相色譜串聯(lián)光檢測(cè)器及脈沖安培檢測(cè)器是目前最為廣泛的測(cè)定食品樣品中糖含量的方法之一，但是其所測(cè)定的食品樣品大多為固體樣品，沒(méi)有將其應(yīng)用于葡萄酒中天然糖進(jìn)行分離分析[20]。

在加氧化還原電壓條件下，糖類(lèi)分子具有電化學(xué)活潑性，且其在強(qiáng)堿溶液中呈離子化狀態(tài)[21]。在OH-存在的條件下，它們會(huì)部分或全部以陰離子形式存在，可以在陰離子交換色譜柱上被分離。離子色譜法檢測(cè)糖主要使用金電極的安培檢測(cè)器。當(dāng)在金電極上施加電壓，糖易在金電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)；在堿性條件下，金電極催化活性非常高；而且糖的檢測(cè)過(guò)程中不需衍生反應(yīng)和復(fù)雜的樣品純化處理。

本研究利用石墨化炭黑做填料的固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）柱對(duì)葡萄酒樣品進(jìn)行處理，通過(guò)陰離子交換色譜法同時(shí)對(duì)進(jìn)口葡萄酒中的8種天然糖進(jìn)行分離，并通過(guò)積分安培檢測(cè)器對(duì)8種糖進(jìn)行檢測(cè)，建立一種葡萄酒樣品中糖的離子色譜分析方法。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

葡萄酒樣品 市售進(jìn)口葡萄酒。實(shí)驗(yàn)所有用水均為經(jīng)Milli-Q去離子水制備裝置制備的電導(dǎo)率不小于18.2 MΩ·cm的去離子水；葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、L-山梨糖、蔗糖、麥芽糖、異麥芽酮糖（帕拉金糖）標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，購(gòu)自上海悌希愛(ài)試劑公司；甲醇（色譜純） 德國(guó)Merck公司；石墨化炭黑及C18填料 美國(guó)Agilent公司。

1.2儀器與設(shè)備

ICS5000+離子色譜儀（帶有DP-5四元梯度泵、AS-AP自動(dòng)進(jìn)樣器、在線淋洗液KOH發(fā)生裝置EGC500+、積分安培電化學(xué)檢測(cè)器及Chromeleon數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）、Dionex CarboPac PA20色譜柱美國(guó)Thermo公司；Milli-Q去離子水制備裝置。

1.3方法

1.3.1色譜條件

淋洗液：KOH溶液；色譜柱：Dionex CarboPac PA20；柱溫：30℃；檢測(cè)器：積分安培檢測(cè)器；工作電極：Au電極；參比電極：Ag/AgCl電極；梯度洗脫條件見(jiàn)表1，檢測(cè)器檢測(cè)波形見(jiàn)表2。

表1 KOH溶液梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

表2 糖測(cè)定的積分安培檢測(cè)波形Table 2 Integrated pulsed amperometric detection waveforms for sugars

1.3.2 樣品前處理

依次使用3 mL去離子水、1 mL甲醇分別活化石墨化炭黑SPE柱，取葡萄酒樣品2.0 mL稀釋5倍后，取5.0 mL經(jīng)SPE柱及0.22μm濾膜過(guò)濾，收集濾液。將濾液稀釋后經(jīng)離子色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1分離條件的選擇

淋洗液中OH-有兩種作用：首先，作為淋洗離子，OH-濃度增大，淋洗能力增強(qiáng)，糖在色譜柱上的保留時(shí)間縮短；其次，OH-提供糖解離為離子所需要的pH值環(huán)境，OH-濃度增大，糖分子的離子化程度提高，其在色譜柱上的保留時(shí)間延長(zhǎng)。因此，糖在色譜柱上的保留時(shí)間是兩種行為共同作用的結(jié)果。由于單糖分子結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)構(gòu)型十分相似，采用等度洗脫時(shí)分離效果較差，因此，采用KOH梯度洗脫的方法，分離效果如圖1所示。在選定的色譜條件下，果糖與L-山梨糖雖然未完全分離，但分離度能夠滿(mǎn)足要求，其余組分分離效果非常好，且所有目標(biāo)峰峰形良好，靈敏度較高。

圖1 8 種糖標(biāo)準(zhǔn)品分離色譜圖Fig.1 Ion chromatographic separation of eight sugar standards

2.2前處理方法的優(yōu)化

在利用離子色譜法對(duì)葡萄酒樣品中糖的測(cè)定時(shí)，起干擾作用的雜質(zhì)主要有偶氮染料（色素）和氨基酸。偶氮染料濃度過(guò)大會(huì)對(duì)離子色譜柱造成傷害，因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須進(jìn)行脫色。于20.0 mL離心管中分別加入0.2 g C18和石墨化炭黑填料，然后加入稀釋20倍的紅葡萄酒樣品10.0 mL，超聲10 min后離心，取上層清液觀察吸附前后溶液顏色的變化，結(jié)果見(jiàn)圖2；將C18及石墨化炭黑作為填料裝填成SPE柱并利用其對(duì)紅葡萄酒樣品進(jìn)行前處理，取濾液經(jīng)稀釋后進(jìn)行離子色譜分析，分析結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 吸附劑吸附前后溶液顏色的變化Fig.2 Color variations of wine before and after adsorption

由圖2和圖3對(duì)比可以得出，石墨化炭黑可以更好地去除葡萄酒樣品中的雜質(zhì)，測(cè)試結(jié)果受雜質(zhì)影響更小。這是由于偶氮染料多含有苯環(huán)，近似平面結(jié)構(gòu)，而石墨分子本身具有片層結(jié)構(gòu)，這就使偶氮染料較容易吸附在石墨化炭黑表面，進(jìn)而將顏色脫去。但是其在脫色的同時(shí)，又會(huì)吸附部分糖分子，造成回收率較差的問(wèn)題。而回收率差的問(wèn)題可以用回收系數(shù)進(jìn)行校正。C18做填料脫色效果較差，離子色譜峰受雜質(zhì)的影響較大，但是其對(duì)糖的回收率較高。綜合各種影響因素，對(duì)葡萄酒中糖的的測(cè)定中，選用石墨化炭黑做SPE柱的填料。

圖3 不同SPE柱處理過(guò)后樣品離子色譜圖對(duì)比Fig.3 Comparison of ion chromatograms based on separation with different SPE columns

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線

在選定條件下對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行離子色譜分析，測(cè)試8種糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)見(jiàn)表3。由標(biāo)準(zhǔn)曲線及其參數(shù)可知，在線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2≥99.87%。8種糖的檢出限（進(jìn)樣量10μL，RSN=3）分別為0.007、0.004、0.005、0.005、0.003、0.014、0.016 mg/L和0.020 mg/L，且均具有較寬的線性范圍（0.06～30 mg/L）。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍、檢出限、定量限Table 3 Linear curve equations, limits of detection and limits of quantification for surgars

2.4加標(biāo)回收率及精密度

為了測(cè)試出離子色譜法串聯(lián)安培檢測(cè)器方法的準(zhǔn)確性，并測(cè)試出準(zhǔn)確性參數(shù)，選取一不含木糖、L-山梨糖、蔗糖、異麥芽酮糖和麥芽糖，且阿拉伯糖、葡萄糖及果糖含量低的樣品作為空白基質(zhì)樣品，測(cè)定其阿拉伯糖、葡萄糖及果糖含量，定為本底質(zhì)量濃度。平行取3份樣品，分低、中、高3個(gè)水平，分別添加一定量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使各組分添加量分別為200.0、500.0、1 000.0 mg/kg。添加標(biāo)準(zhǔn)溶液后，按2.2節(jié)步驟進(jìn)行前處理，平行6次，測(cè)定加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Recover and precision, expressed as relative standard deviation (RSD), of this method

由表4可以看出，在線性范圍內(nèi)的加標(biāo)回收率在81.5%～95.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.9%～8.7%之間，表明方法精密度可滿(mǎn)足分析要求，回收率雖然較差，但是可以通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)歸納校正因子的方法進(jìn)行校正。

2.5樣品分析

表5 樣品分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Anlytical results obtained for real samples mg/L

續(xù)表5mg/L

由表5得出，進(jìn)口葡萄酒中主要含有一種國(guó)標(biāo)中未列入的天然糖：阿拉伯糖，并含有大量的葡萄糖和果糖，少量葡萄酒樣品中含有L-山梨糖，未檢出蔗糖與麥芽糖。其中阿拉伯糖為葡萄生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生，非人工添加結(jié)果檢出。

3 結(jié) 論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出葡萄酒中含有葡萄糖、果糖和阿拉伯糖3種天然糖。甜型或半甜型（半干型）葡萄酒樣品中3種糖的總量遠(yuǎn)高于干型葡萄酒中的含量，這是由于干型葡萄酒在釀造過(guò)程中比甜型葡萄酒增加了一步脫糖工藝。少量葡萄酒樣品中含有L-山梨糖，含量較低。通過(guò)本方法檢測(cè)葡萄酒樣品中糖的含量具有前處理方法簡(jiǎn)單，易于操作的優(yōu)點(diǎn)，適用于葡萄酒樣品中8種常見(jiàn)天然糖的含量測(cè)定。

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Determination of Naturally Occurring Sugars in Wine by Ion Chromatography with Integrated Pulsed Amperometric Detection

MA Jiamin1,2, CUI He1,*, ZHANG Wenhao1, LI Li3, DONG Lizhen1, LI Huixin1
(1. Shandong Extry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266001, China; 2.Qingdao University, Qingdao 266071, China; 3. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China)

We developed a method for the determination of eight naturally occurring sugars in wine by ion chromatography with integral amperometric detection. We used potassium hydroxide (KOH) produced by eluent generator electrolysis for gradient elution. On CarboPac PA20 anion exchange column, all eight target compounds could be separated completely in 30 minutes. The limits of detection ( LODs) of these analytes by the integral amperometric detector were very low, and a wide linear range was found. The relative standard deviations (RSDs) for six replicate determinations varied from 4.9%to 8.7%, and the recoveries of these eight sugars from spiked samples ranged from 81.5%to 95.1%. Our method proved to be simple, fast, sensitive and suitable for the analysis of the eight naturally occurring sugars in wine by achieving good separation without derivatization.

ion chromatography (IC); integral amperometric detector (IAD); wine; naturally occurring sugar

O657.75

A

1002-6630（2015）12-0108-05

10.7506/spkx1002-6630-201512020

2014-09-28

國(guó)家重大科學(xué)儀器研發(fā)專(zhuān)項(xiàng)（2012YQ090229）；國(guó)家質(zhì)檢公益性科研專(zhuān)項(xiàng)（201210012）

馬甲民（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)殡x子色譜及應(yīng)用。E-mail：jiaminma@126.com

*通信作者：崔鶴（1962—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)樯V及色譜聯(lián)用技術(shù)。E-mail：cuihe88@aliyun.com