返魂草有效成分的提取工藝研究

張宏梅 姚 鑫 崔佰吉 馬冬飛

(1 吉林醫藥學院,吉林,132013； 2 吉林敖東醫藥科技有限公司,敦化,133700)

返魂草有效成分的提取工藝研究

張宏梅1姚 鑫2崔佰吉1馬冬飛1

(1 吉林醫藥學院,吉林,132013； 2 吉林敖東醫藥科技有限公司,敦化,133700)

目的:優化返魂草總黃酮的提取工藝。方法:以返魂草中總黃酮含量為考察指標,通過單因素實驗考察超聲時間、溫度、功率等對返魂草有效成分含量的影響,采用正交設計實驗法確定最佳提取工藝。結果:乙醇回流法提取最佳工藝為:提取時間150 min,溶劑70%乙醇,液料比22∶1。結論:乙醇回流法提取返魂草總黃酮操作方便,工藝穩定,重現性好,適于工業化生產。

返魂草;黃酮;正交設計;提取工藝

返魂草為菊科千里光屬植物返魂草的干燥全草,具有利氣化痰、清熱解毒等功效[1-2]。上市的劑型返魂草顆粒和肺寧口服液等,在臨床上廣泛用于治療病毒性感冒、急性呼吸道感染、慢性支氣管炎等疾病[3-4]。目前返魂草活性成分的研究主要有綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、多糖及黃酮類等多種化合物,但對于黃酮類研究的報道較少[5-8]。黃酮類化合物顯示出多種生物活性,故我們采用單因素考察和正交實驗設計提取返魂草中的總黃酮,以含量為考察指標,優選最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

紫外分光光度計(UV1800日本.島津);電子天平(CAP225D Sartorius);冷凍干燥機(Scientz-12SN寧波生物科技股份有限公司);KQ-250DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。蘆丁對照品(100080-201409)購于中國食品生物制品鑒定研究院。返魂草購于吉林市寶恩大藥房,經吉林醫藥學院李景華副教授鑒定為菊科千里光屬植物返魂草(Senecio cannabifolius Less)。

2 方法與結果

2.1 返魂草總黃酮含量測定 精密稱取蘆丁對照品16.42 mg,置10 mL量瓶中,加甲醇溶解,并稀釋至刻度,得對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg置于10 mL容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,定容。分別精密吸取各對照品溶液1.0 mL置25 mL量瓶中,分別加入30%乙醇5 mL,混勻,加入1 mL濃度為5%的亞硝酸鈉溶液,混勻,放置室溫6 min,加入1 mL濃度為5%的硝酸鋁溶液0.3,混勻,放置室溫6 min,再分別加入濃度為4%的氫氧化鈉溶液10.0 mL,混勻,用30%乙醇稀釋至刻度,混勻,室溫放置15 min后于波長510 nm處測定吸光度。蘆丁對照品的濃度C為橫坐標,吸光度A為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程Y=0.4818 C+0.0562(R=0.999 3),表明蘆丁在0.16～0.64 mg/mL的范圍內線性關系良好。

2.2 供試品制備 返魂草藥材粗粉,按照各處方要求稱取適宜的藥材,置于三角瓶中,按照各處方項下的參數進行設定,進行提取。提取液濃縮、冷凍干燥、研成粉末,計算出膏率。精密稱取提取物粉末適量,置50 mL具塞三角瓶中,精密加入25 mL 30%乙醇溶液,溶解,稱定重量,超聲處理30 min,放至室溫,用30%乙醇補足減失重量、混勻,過濾即得。按照標準曲線的測定方法進行總黃酮的含量測定。

2.3 單因素考察實驗

2.3.1 溶劑濃度考察 按“2.2”項下的方法,稱取適量的藥材粗粉,提取時間120 min,考察溶劑濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇時,返魂草總黃酮含量及出膏率的變化。含量及出膏率的變化見圖1。由實驗結果可以看出,隨著乙醇濃度的變化,總黃酮和出膏率也有明顯的變化,但是當濃度達到約60%時,變化趨于穩定狀態,所以選擇乙醇濃度為60%、70%、80% 3個濃度進入正交實驗設計,進一步優化實驗條件。

圖1 溶劑濃度考察結果圖

2.3.2 溶劑用量考察 按照“2.2”項下方法,稱取適量的藥材粗粉,設定提取時間120 min,乙醇濃度60%,溶劑用量分別為藥材量的14、16、18、20、22倍,考察返魂草總黃酮和出膏率的變化趨勢。考察結果見圖2。由實驗結果可以看出,隨著乙醇用量的增加,總黃酮和出膏率都明顯增加,且出膏率的增加趨勢更加顯著,總黃酮含量增加量不十分明顯,根據結果選擇14、18、22倍量進行正交實驗設計的實驗,以優化更佳理想的溶劑用量。

2.3.3 提取時間考察 按照“2.2”項下方法,稱取適量的藥材粗粉,加入20倍量濃度為60%乙醇溶液,設定提取時間分別為45、60、90、120、150 min,考察返魂草總黃酮和出膏率的變化趨勢。考察結果見圖3。由實驗結果可知,隨著提取時間的增加,總黃酮和出膏率均明顯增加,當提取時間增加到90 min時,其增加達到頂點,即再增加提取時間對于整個總黃酮和出膏率的影響不大,所以選擇90、120、150 min進行正交實驗。

圖2 溶劑用量考察結果圖

圖3 返魂草總黃酮和出膏率的變化趨勢

2.4 正交設計實驗 根據單因素實驗的考察結果,采用L9(34)正交設計實驗進行研究,因素水平設置見表1,按照“2.2”項下的方法分別進行各個實驗,分別考察各個條件下的總黃酮和出膏率,以二者的總和作為提取效果的考察指標,考察結果見表2,方差分析結果見表3。

表1 因素水平表

表2 正交設計表及結果

表3 方差分析結果表

由實驗結果可知,對于乙醇回流法提取返魂草總黃酮的的過程,乙醇濃度和溶劑的用量對整個結果的影響較大,3個因素對于結果的影響大小程度分別為:乙醇濃度>溶劑用量>提取時間,且乙醇濃度和溶劑用量均具有顯著性影響(a=0.1),從直觀分析結果我們可以看出最佳的實驗方案為A2B3C3,即:乙醇濃度為70%,溶劑用量為22倍量,提取時間為150 min。

2.5 驗證實驗 按“2.4”項下返魂草總黃酮最佳提取工藝參數,按照“2.2”項下的過程進行3個批次的返魂草總黃酮的提取。返魂草總黃酮含量結果見表4。結果表明,本工藝穩定,可操作性強,適合返魂草總黃酮的提取。

表4 驗證實驗結果表

3 討論

本研究采用蘆丁顯色的方法進行總黃酮的含量測定,方法比較成熟,在經過預實驗的過程中,我們進行了該方法的穩定性、精密度、重復性、回收率等一系列的方法學研究,研究表明各項指標均能滿足返魂草中總黃酮的含量測定的要求。

返魂草的成方制劑為“返魂草顆粒”,即“肺寧顆粒”主要用于肺部疾病的預防和治療,具有悠久的用藥歷史,但返魂草的應用主要集中在返魂草水溶性酚酸類成分,據研究報道,返魂草的黃酮類成分也具有廣泛的抗炎、抗氧化的作用,在肺部疾病的治療過程中也起到一定的積極作用。本研究采用單因素結合正交設計的方法進行返魂草有效成分的提取研究,建立了簡便、易行的工藝設計,為返魂草藥材的合理化應用提供了一定的理論依據。

[1]孫佳丹,王曉波,姜爽,等.返魂草素Ⅱ對全氟異丁烯致大鼠吸入性急性肺損傷的預防作用[J].國際藥學研究雜志,2014，41(4):444-448.

[2]馬鴻雁,楊莉,王長虹,等.HPLC法同時測定返魂草顆粒中6種活性成分[J].中成藥,2012,34(8):1496-1500.

[3]趙春芳,李慶杰,王蓮萍,等.返魂草的高效液相色譜法指紋圖譜研究及成分分析[J].分析化學,2013,41(1):133-136.

[4]李麗靜,王繼彥,王巖,等.返魂草提取物及其有效成分抗病毒作用的研究[J].中國中醫基礎醫學雜志,2005,11(8):585-587.

[5]馬鴻雁,楊莉,王長虹,等.返魂草藥材的HPLC指紋圖譜研究[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(13):101-104.

[6]周世友.返魂草膠囊中綠原酸的含量測定[J].廣西醫科大學學報,2013,30(3):355-357.

[7]鐘芳麗,王曉林,安媛,等.返魂草中總黃酮提取工藝研究[J].中國醫院藥學雜志,2008,28(22):1937-1940.

[8]王志兵,王力,姜海峰,等.返魂草總黃酮的微波提取及響應面優化[J].食品工業,2012(3):3-6.

(2015-07-08收稿 責任編輯：王明)

Research on the Extracting Process of the Active Ingredient from Senecio cannabifolius Less

Zhang Hongmei1, Yao Xin2, Cui Baiji1, Ma Dongfei1

(1JilinMedicalUniversity,Jilin132013,China; 2JilinAodongMedicineScienceandTechnologyCoLtd,Dunhua133700,China)

Objective: To optimize extracting process of flavonoids from Senecio cannabifolius Less. Methods: The ultrasonic time, the optimum extraction conditions and the material ratio were investigated by single element experiment; the optimum extraction conditions were investigated by orthogonal design and with flavonoids from Senecio cannabifolius Less as the content index by Uv results. Results: The best optimum extracting condition was under 70% ethanol, material ratio 22:1, and extracting time lasting for 150 mins. Conclusion: The method is simple, convenient and can be controlled easily, and suitable for the determination of Senecio cannabifolius Less.

Senecio cannabifolius Less; Flavonoids; Orthogonal design; Extracting process

吉林省教育廳,吉教科合字[2014]第549號

張宏梅(1982—),女,講師,從事中藥新劑型與新技術,E-mail:33134016@qq.com

R284.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.09.032