狂犬病毒ELISA抗體檢測試劑盒的初步應用

（瑞普（保定）生物藥業有限公司河北保定071000）

狂犬病毒ELISA抗體檢測試劑盒的初步應用

張德寶，朱秀同，劉濤，李艷莉，柳珊，何平有，郁宏偉，梁武

（瑞普（保定）生物藥業有限公司河北保定071000）

以滅活純化的狂犬病毒SRV9株作為包被抗原，制備了5批次狂犬病毒ELISA抗體檢測試劑盒中試產品。與FAVN法、商品化進口試劑盒相比，該試劑盒與二者總符合率為90.80%和94.25%，且敏感性較高。5批次試劑盒批內變異系數為1.47%～8.34%，批間變異系數為2.05%～8.64%，說明該試劑盒重復性良好，可用于血清中狂犬病毒抗體常規檢測。

狂犬病毒；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）；熒光抗體病毒中和試驗（FAVN）

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的一種高致死性人獸共患傳染病，一旦出現臨床癥狀，死亡率幾乎為100%。狂犬病病毒可以感染幾乎所有的溫血動物，野生動物是其主要的儲存宿主，犬、貓等家養動物是人畜感染RABV最主要的來源，對RABV的攜帶和傳播有重要作用。全世界每年約有3萬～5萬人死于狂犬病，主要分布在亞洲、非洲和拉丁美洲等發展中國家，造成的經濟損失不計其數[1]。

OIE和WHO狂犬病專家委員會認為，血清中的中和抗體≥0.5 IU/mL才具有足夠的保護性，這就使得血清抗體檢測成為預防狂犬病環節中的關鍵一環。目前，對狂犬病毒的血清學診斷方法主要有MNT、RFFIT、FAVN等，但它們存在耗時長、設備成本高等缺點，不方便大規模普及[2,3]。ELISA方法因其簡便快速，易于標準化，更適于大規模樣品的初步篩查[4]。本單位制備的狂犬病毒ELISA抗體檢測試劑盒，建立了一種特異性強、敏感度高的ELISA抗體檢測方法，從而對我國狂犬病的流行病學情況進行動態監測，具有重要的經濟、社會和公共衛生意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株與細胞株狂犬病毒SRV9株及N2a細胞由浙江大學農業部動物病毒學重點實驗室鑒定、保管及供應。

1.1.2主要試劑MEM培養基購自Invitrogen公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；HRP標記的羊抗犬酶標抗體和顯色液由Sigma公司提供；BCA蛋白定量試劑盒，GE公司提供；商品化進口狂犬病抗體檢測試劑盒，購自法國SYNBIOTICS公司；狂犬病毒ELISA抗體檢測試劑盒由瑞普（保定）生物藥業有限公司 提 供， 批 號 2013001、2013002、2013003、2013004、2013005。

1.1.3血清樣本陰、陽性質控血清由浙江大學提供；臨床血清由瑞普生物診斷中心收集并提供，共87份。

1.2方法

1.2.1敏感性試驗 用試制的試劑盒和商品化進口試劑盒同時檢測6份陽性參考血清的抗體滴度，對兩種試劑盒的敏感性進行比較。

1.2.2特異性試驗 用試制的試劑盒對犬細小病毒病、犬偽狂犬病、犬傳染性肝炎、犬瘟熱病毒陽性血清各1份及6份陰性質控血清進行檢測，10份陰性質控血清反應的結果應均為陰性，即S/P值均小于0.103。

1.2.3符合率試驗 取87份犬血清樣本用本試劑盒與熒光抗體病毒中和試驗、商品化進口試劑盒進行檢測，分析符合率。

1.2.4重復性試驗

1.2.4.1批內重復性試驗 用2013001批次的試劑盒，隨機抽取5盒，分別檢測15份血清樣品（5份強陽性血清、5份弱陽性血清、5份陰性血清），測得結果后計算同一批次試劑盒內的變異系數。

1.2.4.2批間重復性試驗 用5批次的試劑盒，每批次隨機抽取1盒，分別同時檢測15份血清樣品（5份強陽性血清、5份弱陽性血清、5份陰性血清），測得結果后計算不同批次試劑盒內的變異系數。

1.2.5 ELISA抗體檢測試劑盒檢測 用狂犬病毒ELISA抗體檢測試劑盒檢測，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.2.6熒光抗體病毒中和試驗（FAVN）采集的血清滅活后以FAVN法檢測狂犬病毒中和抗體，狂犬病毒抗體≥0.5 IU/mL為陽性。FAVN參考《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》進行[5]。

2 結果

2.1敏感性檢驗

6份陽性參考血清抗體滴度，ELISA檢測結果分別為1∶200、1∶800、1∶1200、1∶1600、1∶2400、1∶2400；商品化進口試劑盒檢測結果分別為1∶400、1∶800、1∶1200、1∶1600、1∶3200、1∶3200。在6份陽性參考血清中，血清樣品2、3、4用兩種試劑盒檢測抗體滴度相同，其余3份樣品，本試劑盒的敏感性比國外試劑盒略低。由此可知本ELISA試劑盒敏感性可以滿足常規狂犬病毒抗體滴度的檢測。

2.2特異性檢測

10份陰性質控血清的S/P值均小于0.103，檢測結果為陰性。

2.3符合率試驗

本試劑盒與FAVN、商品化試劑盒同時檢測87份犬血清，結果與FAVN法相比陽性符合率為93.75%（60/64），陰性符合率為82.61%（19/23），總符合率為90.80%（79/87）；與商品化試劑盒相比，陽性符合率為95.28%（62/65），陰性符合率為90.91%（20/22），總符合率均為94.25%（82/87），表明本試劑盒敏感性較高，可用于狂犬病毒中和抗體的檢測（見表1）。

表1 試劑盒與FAVN、進口試劑盒的比較

2.4重復性試驗

2.4.1批內重復性實驗結果 2013001批次內5盒試劑盒分別檢測5份強陽性血清，變異系數在1.77～8.25%之間；5份弱陽性血清，變異系數在1.67%～8.34%之間；5份陰性血清，變異系數在1.47%～7.98%之間。15份血清樣品結果顯示批內變異系數在1.47%～8.34%，說明該試劑盒的批內重復性良好。2.4.2批內重復性實驗結果 5批試劑盒分別檢測5份強陽性血清，變異系數在4.76%～7.85%之間；5份弱陽性血清，變異系數在4.31%～8.64%之間；5份陰性血清，變異系數在2.05%～6.97%之間。15份血清樣品結果顯示批間變異系數在2.05%～8.64%之間。說明該方法具有高度的可重復性，可用于常規檢測。

3 討論

自1997年起，我國部分省份狂犬病發病呈逐年上升趨勢，部分地區疫情上升十分明顯，發病和死亡人數不斷增多，狂犬病已經嚴重威脅國人健康，血清中的中和抗體的監測變得尤為重要。在眾多對狂犬病毒的血清學診斷方法中，ELISA檢測法由于其具有快速、準確、穩定等優點，在眾多檢測方法中脫穎而出。

目前，市場上銷售的ELISA試劑盒品牌較多，但多數存在靈敏度低、批間不穩定等問題[6,7]。本公司試制的狂犬病毒ELISA抗體檢測試劑盒，特異性好。與FAVN法、商品化進口試劑盒相比，在對87份臨床樣品的檢測中，總符合率為91.95%，敏感性較高。且試劑盒批內、批間可重復性高，適合犬血清中的中和抗體的檢測，臨床應用效果良好，對及時發現狂犬病、提高畜牧產業質量，具有重要的經濟、社會和公共衛生意義。■（編輯：趙曉松）

[1] Dodet B.An impootant date in rabies history[J].Vaccine,2007,25 (52):8647-8650.

[2] 扈榮良.狂犬病理論技術與防治[M].北京：科學出版社,2007: 227-229.

[3] Stantic-PavlinicM,Hostinik P,Levinik-Stezinar S,et al.Vaccination against rabies and protective antibodies-comparison of ELISA and florescent antibody virus neutralization (FAVN)assays[J]. Veterinarski Arhiv,2006,76(4):281-289.

[4] Cliquet F,Mü ller T,Mutinelli F,et al.Standardisation and establishment of a rabies ELISA test in European laboratories for vaccine, 2003,21(21-22):2986-2993.

[5] 農業部畜牧獸醫局譯（世界動物衛生組織著）.哺乳動物、禽、蜜蜂A和B類疾病診斷試驗和疫苗標準手冊[M].北京:中國農業科學技術出版社,2002.

[6] 劉華章,黃桂花,曹慶,等.ELISA法與RFFIT法檢測狂犬病疫苗免疫后血清抗體的比較[J].熱帶醫學雜志,2008,8(5):497-499.

[7] 湯恩婉,朱臨坪.兩種不同方法檢測狂犬病免疫抗體的比較[J].海峽預防醫學雜志,2004,10(4):55.

Preliminary Application of Rabies Virus ELISA Antibody Detection Kits

Zhang Debao,Zhu Xiutong,Liu Tao,Li Yanli,Liu Shan,He Pingyou,Yu Hongwei,Liang Wu
(Ringpu(Baoding)Biological Pharmaceutical Co.,Ltd.,Baoding Hebei,071000)

5 batches of rabies virus ELISA antibody detection kits were produced by Ringpu(Baoding) biological pharmaceutical company limited,with the inactivated and purified RABV SRV-9 strain as coating antigen.Parallel testing on 87 clinical serums between the kit and FAVN,imported kit of the same type showed the total accordance rates being 90.80%and 94.25%,respectively.And the coefficients of variation of inter-batch and intra-batch kits were 1.47%～8.34%and 2.05%～8.64%,respectively.The kit was simple, sensitive,specific and suitable for he detection of the positive rabies virus antibody in serum in scale.

rabies virus,ELIA,FAVN