維A酸軟膏中維A酸的含量測定及有關物質的檢查

蔡 樂，姚 蘭，白 林（解放軍總醫院藥品保障中心，北京 100853）

·實驗研究·

維A酸軟膏中維A酸的含量測定及有關物質的檢查

蔡 樂，姚 蘭，白 林（解放軍總醫院藥品保障中心，北京 100853）

目的：建立維A酸軟膏中維A酸的含量測定及有關物質檢查的方法。方法：采用HPLC法測定維A酸的含量。色譜柱：Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇-2%冰醋酸（85 : 15），流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：354 nm，柱溫：45 ℃。結果：維A酸與其他雜質分離良好，與異維A酸的分離度＞ 5。維A酸在0.934 4 ～ 18.687 2 μg·mL-1范圍內線性關系良好（r = 1.000 0）；維A酸的平均回收率為99.4%（RSD = 1.44%，n = 9）。結論：采用該方法測定維A酸軟膏中維A酸的含量操作簡單，結果準確，可作為該制劑的質量控制方法。

高效液相色譜法；維A酸軟膏；含量測定；維A酸；異維A酸

維A酸軟膏收載于《中國人民解放軍醫療機構制劑規范》（2002年版）[1]，由維A酸、凡士林和液體石蠟組成，其中維A酸是維生素A的活性代謝產物，具有促進表皮細胞更新、調節表皮細胞增殖和分化作用，該藥常用于各種類型的扁平苔蘚、毛囊角化病、痤瘡及其他角化異常類皮膚病的治療。在《中國人民解放軍醫療機構制劑規范》（2002年版）中并未記載維A酸軟膏的含量測定方法，維A酸不穩定見光易轉化為其順勢異構體異維A酸，為提高維A酸軟膏的質量標準，更好地控制該制劑的質量，提高臨床用藥的安全性和有效性，本研究建立了測定維A酸軟膏中維A酸的含量及檢查有關物質異維A酸的HPLC方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（包括1200系列在線脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、VWD檢測器和色譜工作站，美國Agilent公司）；AG-285型電子天平（瑞士Mettler公司）；UV-2550型紫外分光光度儀（日本島津公司）。

維A酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度99.4%，批號100224-200903）；異維A酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度99.8%，批號100224-200903）；維A酸軟膏（本院自制，規格：0.025%、20 g/盒，批號20140120-1、20140120-2、20140121）；甲醇為色譜純；乙醇、冰醋酸為分析純；水為重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-2%冰醋酸（85 : 15）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：354 nm；柱溫：45 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品溶液 精密稱定維A酸對照品9.4 mg，置100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為維A酸對照品儲備液。精密稱定異維A酸對照品12.3 mg，置100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為異維A酸對照品儲備液A。精密量取異維A酸對照品儲備液A 1 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為異維A酸對照品儲備液B。精密量取維A酸對照品儲備液2.5 mL和異維A酸對照品儲備液B 4 mL，置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液（含維A酸2.335 9 μg·mL-1和異維A酸0.491 0 μg·mL-1）。

2.2.2供試品溶液 避光操作，取供試品約1.0 g（含維A酸約0.25 mg），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入無水乙醇50 mL，稱定重量，于60 ℃水浴中充分振搖15 min，再置于冰浴中冷卻2 h。取出后用無水乙醇補足重量，迅速濾過，放至室溫后，取續濾液5 mL置10 mL棕色量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

2.2.3陰性對照溶液 另按處方比例及制備工藝，取除維A酸以外的其余成分，配制不含維A酸的空白制劑，依供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統適用性實驗

分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液按“2.1”項下色譜條件，各進樣10 μL，測定HPLC圖譜，考察供試品中維A酸、異維A酸和其他組分色譜峰分離情況。在此色譜條件下，維A酸的保留時間為18.4 min，異維A酸的保留時間為16.3 min，維A酸和異維A酸色譜峰峰形對稱尖銳，分離度大于5，基線平穩，與其他色譜峰分離良好，陰性對照無干擾，見圖1。

2.4 線性關系考察

精密量取維A酸儲備液適量，加流動相配制成含維A酸分別為0.934 4、2.335 9、4.671 8、9.343 6、14.015 4、18.687 2 μg·mL-1的標準溶液。分別精密吸取標準溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定。以峰面積值為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，計算得維A酸的回歸方程為Y = 89.383 X + 1.874 2，r = 1.000 0。結果表明，維A酸在0.934 4 ～18.687 2 μg·mL-1范圍內與峰面積呈良好線性關系。

圖1 維A酸軟膏的HPLC色譜圖A – 陰性對照，B – 對照品，C – 供試品；1 – 異維A酸，2 – 維A酸Fig 1 HPLC chromatogram of tretinoin ointmentA – negative reference substance, B – reference substance, C – sample; 1 – isotretinoin, 2 – tretinoin

2.5 精密度實驗

取“2.2.1”項下對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續進樣6次測定，計算維A酸的峰面積RSD為0.06%（n = 6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復性實驗

取同一供試品（批號20140120-1）約1.0 g，共6份，精密稱定，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算含量RSD為1.73%（n = 6），表明方法重復性良好。

2.7 回收率實驗

取“2.2.3”項下空白制劑9份，分成3組，每組3份，每份約1.0 g。分別精密加入一定量的維A酸對照品儲備液，于50 ℃微溫下與空白制劑混合，再按供試品溶液制備方法制成含量約為供試品標示量的80%、100%、120%的樣品溶液。按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算回收率，結果見表1。

表1 維A酸軟膏回收率實驗測定結果.n= 9Tab 1 Results of recovery test about tretinoin ointment.n= 9

2.8 樣品含量測定

取3批樣品（批號20140120-1、20140120-2、20140121），每批3份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，以外標法計算各個樣品中維A酸的含量，結果見表2。

表2 維A酸軟膏中維A酸的含量.n= 3Tab 2 Determination of contents of tretinoin in tretinoin ointment.n= 3

2.9 異維A酸限量檢查

取3批樣品（批號20140120-1、20140120-2、20140121），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依照“2.1”項下色譜條件，40 μL進樣測定。供試品溶液色譜圖中若有與異維A酸保留時間一致的色譜峰，其峰面積不得大于對照品溶液10 μL進樣時異維A酸峰面積的5%。經測定，3批樣品異維A酸的限量均符合規定。

3 討論

3.1 維A酸含量測定方法的選擇

維A酸的含量測定方法主要有UV法[2-3]和HPLC法[4-6]。經實驗發現，維A酸軟膏中凡士林等基質和異維A酸等雜質在維A酸最大吸收波長處均有吸收，對紫外分光光度法測定存在影響，采用HPLC法則可避免基質和雜質對維A酸測定的干擾，并可對制劑中的雜質進行限量檢查。由于軟膏基質黏度大，成分復雜，處理不當易造成色譜柱堵塞。因此，本實驗在參考文獻基礎上，對提取條件等進行了優化。

3.2 色譜條件的選擇

研究中曾參考文獻[6]維A酸原料藥含量測定項下的流動相甲醇-2%冰醋酸（81 : 19）進行實驗，但采用該配比測定時維A酸的出峰時間偏長（約30 min），且峰形寬。經實驗發現維A酸對甲醇的比例變化敏感，維A酸在甲醇-2%冰醋酸（90∶10）的條件下，出峰時間可縮短為10 min左右，但維A酸與異維A酸的分離度 ＜ 5；而維A酸在甲醇-2%冰醋酸（85∶15）的條件下，出峰時間為18 min左右，維A酸與異維A酸的分離良好（分離度 ＞ 5），為此確定流動相為甲醇-2%冰醋酸（85∶15）。通過掃描維A酸標準溶液的紫外圖譜，發現維A酸在354 nm處有最大吸收，因此選擇354 nm為檢測波長。

3.3 提取條件的選擇

本研究分別以無水乙醇、甲醇和流動相作為溶劑提取樣品，發現無水乙醇的提取率明顯高于甲醇和流動相。為減小供試品溶液對色譜柱的損壞，使用無水乙醇提取后，可冰浴2 h使軟膏基質沉淀，濾過后再用流動相稀釋進一步析出雜質，最后用0.22 μm微孔濾膜濾過后進樣[7]。此外，對提取時間和溫度進行優化，發現60 ℃水浴時充分振搖15 min即可完全提取樣品。

3.4 維A酸的穩定性

本研究考察了光線對維A酸穩定性的影響。實驗結果表明，維A酸溶液在室溫光照條件下極不穩定，1 h含量下降近20%，8 h含量下降超過60%；而維A酸在室溫避光條件下，12 h基本穩定，因此實驗操作中要注意嚴格避光。

由于維A酸不穩定，見光易轉化為異維A酸，而異維A酸具有較強的致畸作用，因此應對制劑中異維A酸的含量進行限制。參考文獻[6]維A酸乳膏中的檢查方法，本研究將供試品40 μL進樣中異維A酸峰面積限定為不大于對照品溶液（10 μL進樣）中異維A酸峰面積的5%，經檢查所配制的3批樣品均符合規定。

綜上，采用HPLC法操作簡便，準確性高，重復性好，可作為維A酸軟膏中維A酸含量測定及有關物質檢查的方法。

[1] 中國人民解放軍總后勤衛生部.中國人民解放軍醫療機構制劑規范（2002年版）[S].北京：人民軍醫出版社，2003：166.

[2] 姜武民，黃波.維A酸乳膏(0.025%)含量測定方法的探究[J].實用藥物與臨床，2011，14（3）：229-230.

[3] 吳畏，陳雅，楊征，等.紫外分光光度法測定維 A 酸軟膏的含量[J].中國藥業，2012，21（2）：36-37.

[4] 王福霞，馮文菊，姜武民.HPLC法測定維A酸與異維A酸含量[J].藥物分析雜志，2007，27（4）：585-587.

[5] 魏立明，宋霞，宋三孔，等.HPLC雙波長法同時測定復方維A酸軟膏中2主藥的含量[J].中國藥房，2012，23（8）：737-739.

[6] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（二部）[S]. 2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：893-894.

[7] 蔡樂，白林，徐風華，等.HPLC法測定薄荷苯酚軟膏中苯酚的含量[J].中國藥物應用與監測，2014，11（2）：82-84.

Determination of tretinoin and its related substance in tretinoin ointment

CAI Le, YAO Lan, BAI Lin(Department of Pharmaceutical Care, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

Objective:To establish the HPLC method for determination of tretinoin and its related substance in tretinoin ointment.Methods:HPLC analysis was carried out on a column of Agilent Zorbax SB C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with mobile phase consisted of methanol -2% glacial acetic acid solution (85 : 15), the flow rate was 1.0 mL·min-1, the detection wavelength was set at 354 nm and column temperature was 45 ℃.Results:The separation between tretinoin and other impurities was well under this chromatographic condition, and separating degree of tretinoin and isotretinoin was ＞ 5. The calibration curve of tretinoin was linear in the ranger of 0.934 4 – 18.687 2 μg·mL-1(r = 1.000 0). The average recovery of tretinoin was 99.4% (RSD = 1.44%, n = 9).Conclusion:This method is simple, accurate and feasible, which can be applied as the quantitative method for the determination of tretinoin in tretinoin ointment.

HPLC; Tretinoin ointment; Content determination; Tretinoin; Isotretinoin

R917

A

1672 – 8157(2015)03 – 0144 – 03

2014-09-08

2015-01-20）

軍隊醫療機構制劑標準提高科研專項重點課題：半固體制劑標準提高系列研究（13ZJZ05）

白林，女，主任藥師，研究方向：藥物分析、醫院藥學。E-mail：bailin301@126.com

蔡樂，男，主管藥師，主要從事藥物分析、醫院藥學工作。E-mail：caile15009@163.com