星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化鹽酸普萘洛爾凝膠處方基質(zhì)*

楊柳，王愛武，徐廣琪，霍然

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化鹽酸普萘洛爾凝膠處方基質(zhì)*

楊柳1，王愛武2，徐廣琪3，霍然3

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355；2.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院藥劑科，濟(jì)南 250021；3.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院燒傷整形科，濟(jì)南 250021)

目的 對(duì)鹽酸普萘洛爾凝膠處方基質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化。方法 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，以處方中影響較為顯著的甘油(A)、聚乙二醇-400(B)、羥丙甲纖維素(C)的加入量為考察因素，高效液相色譜法測(cè)定鹽酸普萘洛爾8 h單位面積累積透過量為考察指標(biāo)，用二次多項(xiàng)式模型描述考察指標(biāo)和3個(gè)考察因素之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，繪制效應(yīng)面和等高線圖，確定較優(yōu)處方基質(zhì)并進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 優(yōu)選的基質(zhì)處方為甘油18.53%、聚乙二醇-400 8.54%、羥丙甲纖維素2.35%，單位面積累積透過量的二次多元回歸模型：R1=-7 415.69+306.10A+167.47B+4 820.59C-8.26A2-9.81B2-1 025.75C2，累積透過率約為49.6%。結(jié)論 通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法得到鹽酸普萘洛爾凝膠處方基質(zhì)優(yōu)化模型，制備的鹽酸普萘洛爾凝膠性質(zhì)穩(wěn)定、質(zhì)量可控。

普萘洛爾，鹽酸；凝膠；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法；色譜法，高效液相

普萘洛爾為非選擇性β-受體阻斷藥，臨床上主要用于治療心絞痛、心律失常、高血壓等疾病[1]。2008年研究發(fā)現(xiàn)普萘洛爾可用于血管瘤的治療[2]，臨床研究表明口服普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤有效[3]，能夠促進(jìn)瘤體萎縮變薄。口服普萘洛爾有可能導(dǎo)致低血糖、低血壓等不良反應(yīng)[4-5]，首關(guān)效應(yīng)強(qiáng)，生物利用度低。因此，將普萘洛爾透皮給藥并直接作用于血管瘤患處，給藥方便，減少不良反應(yīng)。目前，常用的透皮給藥劑型包括軟膏劑、凝膠劑、貼劑、氣霧劑等。凝膠劑是一類含有溶解、混懸或乳劑型狀態(tài)藥物的乳膠稠厚液體或半固體制劑，涂布以后可形成一層薄膜，具有定點(diǎn)給藥、局部滲透、不污染衣物、易于除去、無皮膚刺激性的特點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)將普萘洛爾做成凝膠劑型，以避免其肝臟首關(guān)效應(yīng)，增加局部濃度，增強(qiáng)療效。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)(central composite design，CCD)是國(guó)內(nèi)外近年來集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法于一體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，是由二水平析因設(shè)計(jì)加軸點(diǎn)及中心點(diǎn)組成，多采用三因素五水平非線性擬合。與單因素實(shí)驗(yàn)、正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)等線性模型相比，具有精度高、預(yù)測(cè)性好、實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少等優(yōu)點(diǎn)[6-11]。筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)鹽酸普萘洛爾凝膠劑的基質(zhì)處方進(jìn)行優(yōu)化，旨在得到穩(wěn)定性好、質(zhì)量可控、透皮性能良好的鹽酸普萘洛爾凝膠劑。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 動(dòng)物 健康Wistar大鼠，體質(zhì)量175～225 g，雌雄各半，無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2013-0107。實(shí)驗(yàn)室溫度(25±1) ℃，相對(duì)濕度60%。

1.2 試藥 鹽酸普萘洛爾對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100783-200401，含量≥98%)；鹽酸普萘洛爾原料藥(湖北興銀河化工有限公司，批號(hào)：20110712，含量≥99%)；羥丙甲纖維素(hydroxy-propyl methyl cellulose，HPMC，曲阜市藥用輔料有限公司，批號(hào)：20130101)；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、三乙胺、磷酸、氯化鈉、氯化鉀、乙醇、甘油、聚乙二醇-400(PEG-400)、羥苯乙酯均為分析純；乙腈、甲醇為色譜純。

1.3 儀器 Waters 600C高效液相色譜儀(Waters2487紫外檢測(cè)器，Empowers色譜工作站)；ZTY智能透皮實(shí)驗(yàn)儀(河南省鞏義市科瑞儀器有限公司，型號(hào)：TP-3A)；BSA224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，感量：0.1 mg)；BSA223S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，感量：1 mg)；KQ-600DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司) ；FE20 型 pH 酸度計(jì)(梅特勒-托利多公司) 。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸普萘洛爾凝膠的制備 稱取處方量甘油、HPMC，加入研缽中研勻，加入適量純化水充分溶脹得凝膠基質(zhì)A；將處方量鹽酸普萘洛爾溶于適量純化水中得溶液B；將處方量的PEG-400和羥苯乙酯溶于乙醇中得溶液C。在攪拌狀態(tài)下，緩慢向A中加入溶液B和C，邊加入邊攪拌至均勻，加純化水至500 g，即得。

2.2 含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀磷酸鹽緩沖液(含0.1 %三乙胺，加磷酸溶液調(diào)pH值至3.5)= 37：63 ；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm；進(jìn)樣量：20 μL[11]。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的鹽酸普萘洛爾對(duì)照品9.8 mg，至 25 mL量瓶中，用pH值7.4磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)溶解并定容，搖勻，得濃度為392.0 μg·mL-1的鹽酸普萘洛爾對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取普萘洛爾凝膠1 g，置于 10 mL 量瓶中加PBS稀釋至近刻度線，超聲至凝膠分散均勻，定容。所得溶液用內(nèi)徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液20 μL進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算含量。同法制得空白輔料供試品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液 0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，4.0 mL，分別置于 10 mL 量瓶中，分別用PBS稀釋并定容，搖勻，精密吸取 20 μL進(jìn)樣，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，鹽酸普萘洛爾對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。線性方程為：Y=15 012X-9 261.5(r= 0.999 8)，結(jié)果表明，鹽酸普萘洛爾在濃度為 7.84～156.8 μg·mL-1范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定鹽酸普萘洛爾的色譜峰面積，結(jié)果峰面積的RSD為 1.18%，表明測(cè)試儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液分別在 0，2，4，8 h，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定鹽酸普萘洛爾的色譜峰面積，結(jié)果峰面積的 RSD 為1.78%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 回收率實(shí)驗(yàn) 取空白凝膠基質(zhì)接收液6 份，分別精密加入鹽酸普萘洛爾對(duì)照品適量，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為99.37%，RSD為1.29%。

2.2.8 凝膠劑的含量測(cè)定 制備3批處方經(jīng)優(yōu)化后的含藥量為2%凝膠。按“2.2.1”項(xiàng)下操作進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 鹽酸普萘洛爾凝膠含量測(cè)定結(jié)果

Tab.1 Results of content determination on propranolol hydrochloride gel

%，n=3

2.3 體外透皮實(shí)驗(yàn)

2.3.1 離體皮膚的制備 將大鼠腹部用寵物剃毛刀進(jìn)行脫毛，飼養(yǎng)1 d，保證脫毛部位皮膚無損傷。實(shí)驗(yàn)時(shí)取大鼠完整離體皮膚，用0.9%氯化鈉溶液洗凈，濾紙吸干，4 ℃冰箱短期保存，備用。

2.3.2 體外透皮實(shí)驗(yàn) 用濾紙吸干大鼠皮表面水分，角質(zhì)層向上夾于擴(kuò)散池中，在大鼠皮上均勻涂上不含藥粉的空白凝膠基質(zhì)及不同處方組成的鹽酸普萘洛爾凝膠各0.2 g，接收池加入磁子并加滿pH值7.4的PBS溶液。將擴(kuò)散池置于(32.0±0.5) ℃的恒溫水浴槽中，攪拌速度恒定。分別于1，2，4，6，8 h取出接收液15 mL，同時(shí)補(bǔ)加相同體積且等溫的緩沖液。取出各時(shí)段的透皮接收液，用內(nèi)徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液20 μL進(jìn)樣，記錄峰面積。

2.3.3 參數(shù)計(jì)算 按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件對(duì)接收液進(jìn)行含量測(cè)定。通過外標(biāo)法計(jì)算接收液中鹽酸普萘洛爾的含量。含量測(cè)定后，按下式計(jì)算單位面積(cm2)藥物累積滲透量(Q)：Q=[Cn·V+∑(Ci×15)]/S。其中，Q：藥物單位面積經(jīng)皮累積滲透量，S：有效皮膚滲透面積，V：接收池中接收液體積，Ci：第1次至上次取樣時(shí)接收液中藥物濃度，Cn：該次取樣時(shí)接收液中藥物濃度。

2.4 處方優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

2.4.1 因素水平 鹽酸普萘洛爾凝膠劑的體外透皮吸收行為受諸多因素的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面原理，采用 Design-Expert實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件(8.05b原版) 輔助設(shè)計(jì)，將影響較為顯著的 3 個(gè)因素作為考察對(duì)象，5 個(gè)水平的代碼分別為0，±1，±α，α=(F)1 /4，F(xiàn)=2k(k為因素?cái)?shù)) 為析因設(shè)計(jì)部分實(shí)驗(yàn)次數(shù)。因素及水平見表 2。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)的因素水平表

Tab.2 Factors and levels of central composite design

%

2.4.2 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3個(gè)因素分別為甘油(A)、PEG-400(B)和HPMC(C)的量，優(yōu)化指標(biāo)R1為鹽酸普萘洛爾單位面積累積通過量，其他組成和制備方法不變。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表 3。

2.4.3 二次回歸模型的建立 根據(jù)表3的結(jié)果，利用 Design-Export實(shí)驗(yàn)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，并以置信度(P) 作為模型判定的標(biāo)準(zhǔn)，建立數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，去掉對(duì)指標(biāo)無顯著性影響(P>0.05) 的項(xiàng)，得二次多元回歸模型：R1=-7 415.69+306.10A+167.47B+4 820.59C-8.26A2-9.81B2-1 025.75C2。由回歸方程的置信度(P<0.05)和復(fù)相關(guān)系數(shù)(R2=0.94) 可知，設(shè)計(jì)模型擬合程度良好，甘油 (A) 的用量及PEG-400(B) 的用量有極顯著的影響，可以用此模型對(duì)鹽酸普萘洛爾凝膠處方基質(zhì)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Tab.3 Central composite design and its results

15～20號(hào)為重復(fù)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值表示data 15-20 of repetitive experiments were represented as mean

2.4.4 優(yōu)化及預(yù)測(cè) 根據(jù)“2.4.2”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Export 8.05b軟件繪制R1的預(yù)測(cè)等高線圖及效應(yīng)面圖 (將其他一個(gè)自變量設(shè)為中心點(diǎn)值)，見圖1。

根據(jù)所得擬合方程及效應(yīng)面，軟件給出優(yōu)化處方工藝下各因素與指標(biāo)的預(yù)測(cè)值，結(jié)果A為18.53%，B為8.54%，C為2.35%，R1為1 798.69 μg·cm-1。

2.4.5 最優(yōu)處方工藝驗(yàn)證 按照以上優(yōu)化處方工藝，制備 3批普萘洛爾凝膠劑，并對(duì)實(shí)際的單位面積累計(jì)透過量進(jìn)行測(cè)算。結(jié)果實(shí)測(cè)值為1 680 μg·cm-1。將實(shí)測(cè)值(V實(shí)測(cè)) 與預(yù)測(cè)值(V預(yù)測(cè))比較，偏差(%)=(V實(shí)測(cè)-V預(yù)測(cè))/V預(yù)測(cè)×100%，偏差越小說明所建立的模型預(yù)測(cè)性越好，本實(shí)驗(yàn)偏差=6.60%，表明可預(yù)測(cè)性良好，累積透過率約為49.6%。

3 討論

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法在進(jìn)行最優(yōu)處方篩選時(shí)，效應(yīng)與因素之間的關(guān)系可能是線性的，也可能是非線性的，表現(xiàn)在效應(yīng)面上，線性的為平面，非線性的為曲面。在整個(gè)考察范圍內(nèi)，在距離較佳區(qū)域較遠(yuǎn)的地方接近線性，愈接近較佳區(qū)，面的彎曲度就越大，即在較佳區(qū)，非線性關(guān)系居多，從效應(yīng)面上直接讀取較佳工藝條件。本實(shí)驗(yàn)效應(yīng)面顯示，甘油和PEG-400對(duì)藥物累積透過量的影響較大。

圖1 累積透過量對(duì)各因素的預(yù)測(cè)等高線及效應(yīng)面圖

Fig.1 Predicted contour line and response surface of accumulative penetration amount versus other factors

在鹽酸普萘洛爾凝膠劑制備過程中，比較羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉和HPMC的成形性。羧甲基纖維素鈉由于受pH值影響較大，加入普萘洛爾藥粉之后溶脹性變差，有白色索狀物析出；聚丙烯酸鈉加入水溶脹之后稠度很大，加入其他基質(zhì)和藥粉不易攪拌均勻，并且靜置后氣泡很難去除；HPMC可克服以上兩種基質(zhì)的缺點(diǎn)，因此對(duì)其進(jìn)行單因素考察，當(dāng)HPLC的含量超過3%時(shí)，制備的凝膠劑較稠，不易涂布且涂布不勻；含量過低時(shí)，制備的凝膠劑流淌性較大，不易成膜，確定其含量范圍為2%～3%。甘油的加入量對(duì)HPMC的溶脹程度有顯著影響，隨著甘油量的加大，HPMC溶

脹由易變難，通過單因素考察可知其含量應(yīng)控制在30%以內(nèi)。

本實(shí)驗(yàn)以甘油、PEG-400、HPMC的加入量為因素，8 h單位面積累積透過量為指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化鹽酸普萘洛爾凝膠劑的最佳基質(zhì)處方為甘油18.53%、PEG-400 8.54%、HPMC2.35%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化的實(shí)測(cè)值與理論值相差不大，制備的凝膠劑質(zhì)量可控，透皮吸收性能較好。

[1] 楊寶峰.藥理學(xué)[M].7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：325-328.

[2] LEAUTE-LABREZE C，DUMAS DE LA ROQUE E，HU-BICHE T，et al.Propranolol for severe hemangiomas of infancy[J].N Engl J Med，2008，358(24)：2649-2651.

[3] 盧靜靜，黃美蓮，付桂莉，等.普萘洛爾治療嬰幼兒復(fù)雜性血管瘤60例[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，33 (8)：1047-1049.

[4] SIEGFRIED E C，KEENAN W J，AL-JUREIDINI S.More on propranolol for hemangiomas of infancy[J].N Eng J Med，2008，359(26)：2846-2847.

[5] HOLLAND K E，F(xiàn)RIEDEN I J，F(xiàn)ROMMELT P C，et al.Hypoglycemia in children taking propranolol for the treatment of infantile hemangioma[J].Arch Dermatol，2010，146(7)：775-778.

[6] JALEH V，SOLMAZ G，MOHAMMAD R K，et al.Deve-lopment and optimization of solid lipid nanoparticles of amikacin by central composite design[J].J Lipos Res，2010，20(2) ：97-104.

[7] 阮洪生，曹玲，陳志寶，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選金蕎麥提取工藝[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，32 (2)：226-229.

[8] 谷麗艷，張立德，張昊，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化健脾益氣湯的提取工藝[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，32 (7)：929-933.

[9] 劉艷杰，項(xiàng)榮武.星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法在藥學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的應(yīng)用[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2007，24(6)：455-457.

[10] 袁玉霞，關(guān)延彬，周寧，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)方左氧氟沙星原位凝膠的制備工藝[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，33 (4)：481-484.

[11] 趙慶沛.測(cè)定鹽酸普萘洛爾片含量的高效液相色譜法分析[J].中國(guó)衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2013，11(5)：104.

Formulation Optimization of Propranolol Hydrochloride Gels by Central Composite Design-Response Surface Methodology

YANG Liu1, WANG Aiwu2, XU Guangqi3, HUO Ran3

(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China；2.DepartmentofPharmacy,ProvincialHospitalAffiliatedtoShandongUniversity,Jinan250021,China；3.DepartmentofPlasticSurgery,ShandongProvincialHospital,ShandongUniversity,Jinan250021,China)

Objective To optimize the matrix formula of propranolol hydrochloride gels. Methods On the basis of single factor experiment, central composite design-response surface method was used to optimize the formula.Addition levels of glycerol (A), PEG-400 (B) and HPMC (C) were evaluated as the independent variables.Eight-hour accumulative penetration amount per unit area measured by HPLC was used as the index.Quadratic polynomial was used to estimate the relationship between the index and the independent variables, and to delineate response surface and overlay contour plots in order to select the optimal formulations.Finally, predicted responses were verified. Results The optimized formula consisted of 18.53% glycerol, 8.54% PEG-400 and 2.35% HPMC.The quadratic polynomial regression model of 8-h accumulative penetration amount per unit area:R1=-7 415.69+306.10A+167.47B+4 820.59C-8.26A2-9.81B2-1 025.75C2, and the cumulative transmittance was 49.6%. Conclusion A credible model is established by using central composite design-response surface method and the formula of propranolol hydrochloride gels is optimized and the gel is stable and controllable.

Propranolol hydrochloride；Gels；Central composite design response method；Chromatography, high performance liquid

2014-10-20

2014-12-20

*山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2013GSF11806)

楊柳(1989-)，女，山東濟(jì)南人，碩士，研究方向：醫(yī)院新制劑開發(fā)及臨床藥學(xué)研究。電話：(0)15269179795，E-mail：yangliu930901@163.com。

王愛武(1966-)，女，山東菏澤人，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向：醫(yī)院新制劑開發(fā)及臨床藥學(xué)研究。電話：(0)15168888315，E-mail：wangaw66@163.com。

R972.4；TQ460.6

B

1004-0781(2015)10-1343-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.022