酶解-UPLC-MS/MS法同時測定咸鴨蛋黃中的11種膽固醇氧化物

柯星黃百芬呂美玲莫衛民任一平（浙江工業大學化學工程學院,杭州004）（浙江省疾病預防控制中心,杭州005）（安捷倫科技中國有限公司,北京000）

酶解-UPLC-MS/MS法同時測定咸鴨蛋黃中的11種膽固醇氧化物

柯星1黃百芬*E-mail：bfhuang@cdc.zj.cn；movm@zjut.edu.cn2呂美玲3莫衛民*E-mail：bfhuang@cdc.zj.cn；movm@zjut.edu.cn1任一平21（浙江工業大學化學工程學院,杭州310014）2（浙江省疾病預防控制中心,杭州310051）
3（安捷倫科技中國有限公司,北京100102）

建立了酶解-超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）同時檢測咸鴨蛋黃中11種膽固醇氧化物（COPs）的方法。咸鴨蛋黃樣品經過脂肪酶37℃酶解,正己烷-乙醚混合液（8∶2,V/V）提取,Silica固相萃取柱凈化。采用Waters HSST3柱（100mm×2.1mm,0.3μm）,以0.1％甲酸的水相和甲醇/乙腈（1∶1,V/V）混合液的有機相梯度洗脫,實現了11種COPs的基線分離。以d7-7α-OH-膽固醇為內標,在APCI-MS/MS MRM模式下定量檢測。結果表明,11種COPs在對應的20～1200 ng/mL和200～3500 ng/mL線性范圍內,相關系數均大于0.996,3個加標水平的回收率在79.3％～104.1％之間,日間RSD在2.0％～12.9％之間；定量限范圍在0.08～0.40μg/g之間。本方法具有較好的重復性和準確性,并成功應用于咸鴨蛋黃中的11種COPs含量的分布檢測。

膽固醇氧化物；咸鴨蛋黃；酶解；液相色譜串聯質譜

1 引 言

膽固醇廣泛存在于肉、蛋以及奶制品等動物源性食品中[1],其在光和氧氣的作用下易被氧化形成膽固醇氧化產物（COPs）。近年來,由于COPs對人體健康有著不利的影響而受到人們的廣泛關注。COPs被證明是誘發動脈硬化癥的主要原因,具有潛在的細胞毒性、致突變性及致癌性,且不同結構的COPs有著不同的毒性[2～7]。通常認為,新鮮的食物中COPs的含量較低[8]。但對食物不恰當的儲存、烹飪、脫水、油炸、腌制等加工都會促進膽固醇轉化為COPs[9～14],咸鴨蛋是中國居民的一種日常食物,咸鴨蛋黃中的COPs含量及其主要異構體分布情況,鮮有文獻報道。因此,建立一套能同時分離測定咸鴨蛋黃中COPs異構體的分析方法,對摸清咸鴨蛋黃中COPs的含量及其異構體分布情況具有十分重要的意義。

目前分離檢測COPs的方法主要為氣相色譜法（GC）和高效液相色譜法（HPLC）。GC具有較高的分辨率[15],但由于COPs的熱不穩定性,需通過衍生化來提高熱穩定性和揮發性[16～19]。HPLC可在常溫條件下分離COPs[20,21],通過紫外或質譜檢測,紫外檢測器在COPs的檢測上有較高的靈敏度,但因COPs的吸收大多在低波段,選擇性較差,且膽固醇5α,6α-環氧化物、膽固醇5β,6β-環氧化物和膽甾烷-3,5,6-三醇無紫外吸收,無法用紫外檢測。串聯質譜法檢測 COPs可以降低基質背景,提高靈敏度[15,22]。

樣品中的COPs含量低,易轉化,在樣品前處理過程中需要將COPs從脂質組分中選擇性分離、純化和富集,須防止人為產生COPs或導致其相互轉化[8,23～25]。目前主要的前處理方法有脂質提取后過固相萃取柱法[26]和皂化提取后過固相萃取柱法[22]。脂質提取后過固相萃取柱法不需要在堿性條件下加熱,可避免膽固醇的人為轉化,但因不能測定酯化的膽固醇氧化物而致樣品中的總COPs含量被低估[27]。皂化法可將酯化的COPs釋放出來,提取后通過固相萃取柱純化,但在強堿性介質中,7-酮基膽固醇易降解為膽甾-3,5-二烯-酮[24],無法保證7-酮基膽固醇的絕對回收率。

本研究建立了一種以酶解法串聯固相萃取柱為前處理,超高效液相色譜分離,APCI源串聯三重四級桿質譜檢測,同位素內標法同時定量咸鴨蛋黃中的11種膽固醇氧化物（COPs）的方法。并將本研究建立的前處理方法與直接提取法及皂化法進行了比較。研究發現,酶解法通過脂肪酶的酶解作用,達到了水解脂質同時釋放酯化COPs的目的,并且由于反應在弱堿性的磷酸鹽緩沖液中進行,7-酮基膽固醇得到保護,未被降解。因此本方法與皂化法和直接提取法相比,具有提取率高,重復性好等優點。本研究在咸鴨蛋中檢出了7α-羥基膽固醇、7-酮基膽固醇、膽固醇5α,6α-環氧化物、膽固醇5β,6β-環氧化物和膽甾烷-3,5,6-三醇等7種COPs,在咸鴨蛋中未檢出22R-羥基膽固醇、20α-羥基膽固醇、25-羥基膽固醇和22S-羥基膽固醇。本研究同時監測了鴨蛋腌制過程中COPs的含量變化情況,發現COPs總含量呈先上升后下降的趨勢,在15天時總含量達到最高。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀和6460三重四級桿質譜儀（美國Agilent公司）；高速離心機（美國Beckman公司）；超純水機（美國Millipore System公司）。

20α-羥基膽固醇、25-羥基膽固醇、19R-羥基膽固醇、22R-羥基膽固醇、22S-羥基膽固醇、膽甾烷-3,5, 6-三醇,7α-羥基膽固醇、7β-羥基膽固醇、膽固醇5α,6α-環氧化物、膽固醇5β,6β-環氧化物、7-酮基膽固醇標準品和d7-7α-羥基膽固醇同位素內標,均購自Sigma公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、乙醚和甲酸（HPLC級,美國TEDIA公司）；硅膠固相萃取柱（500 mg,Waters公司）,脂肪酶（活力為800 U/mg,購自igma公司）；Na2HPO4和NaH2PO4（化學純,阿拉丁公司）；鴨蛋樣品均采購自杭州超市和農貿市場。

2.2 樣品制備

2.2.1 鴨蛋黃的制備將超市購得的熟咸鴨蛋的蛋黃與蛋白分離,將蛋黃放入均質機進行均質,制得鴨蛋黃樣品。參照文獻[28]中的傳統咸鴨蛋腌制方法,選購同一批次新鮮鴨蛋,放入飽和食鹽水中,儲存于避光陰涼的室內,每隔5天取出10只腌制的鴨蛋,放入1 L水,水煮20 min,將蛋黃分離,放入均質機中進行均質。

2.2.2 酶解準確稱取0.1 g（精確至0.0001g）蛋黃樣品放入50 mL離心管,加入同位素內標d7-7α-羥基膽固醇200 ng,加入10 mL含5600 U/mL脂肪酶的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液 （pH=8.2）,渦旋10 min后放入37℃水浴振蕩酶解8 h。

2.2.3 提取酶解液中加入5mL乙腈沉淀蛋白,加入20 mL正己烷-乙醚（80∶20,V/V）混合液提取,渦旋10min,9391 g離心5min,分取上清液后,取下層液重復提取1次,合并上清液,加入10mL超純水,振蕩水洗,轉移有機相至50 mL蒸發瓶中,37℃條件下減壓蒸干,加入5 mL正己烷復溶。

2.2.4 凈化固相萃取柱法參考文獻[29]的方法。選用規格為500mg的硅膠柱,首先用8mL乙酸乙酯活化,加入10mL正己烷平衡。將樣品溶液上樣,依次加入10mL正己烷-乙醚（95∶5,V/V）和25 mL正己烷/乙醚（90∶10,V/V）淋洗,最后加入8mL甲醇/丙酮（3∶1,V/V）進行洗脫,氮吹后用2 mL甲醇復溶,過0.22μm濾膜后,待進樣。

2.3 儀器測定條件

2.3.1 色譜條件選擇了Waters HSST3柱（100 mm×0.3μm）作為色譜柱分離COPs,柱溫40℃,進樣量5μL,以含0.1％甲酸的甲醇/乙腈（1∶1,V/V）混合液作為流動相B,含0.1％甲酸作為流動相A,流速為0.8 mL/min。洗脫梯度：0～16.5 min,70％B；16.5～17.0 min,70％ ～82％B；17.0～18.0 min,82％B；18.0～18.5 min,82％ ～87％B；18.5～21.0 min,87％B；21.0～21.5 min, 87％～95％B；21.5～23.0 min,95％B；23.0～23.1 min,95％～100％B；23.1～25.0min,100％B；25.0～25.1 mim,100％～70％B；25.1～28 min,70％B。

2.3.2 質譜條件大氣壓化學源（APCI）正離子模式,干燥氣溫度300℃,蒸發器溫度450℃,干燥氣流量6 L/min,霧化器壓力3.45 Pa,毛細管電壓4500 V,電暈電流4μA,其它質譜參數及離子對見表1。

表1 COPs及同位素內標的質譜分析參數Table 1 MS/MS parameters for cholesterol oxidation products（COPs）and d7-7α-OH

3 結果與討論

3.1 色譜及質譜條件的優化

本研究共檢測了11種COPs（見表2）,除7-酮基膽固醇外,其余COPs具有相同的分子質量,當其離子化后,均失去1個或2個水分子,生成的離子對相同,無法通過MRM多通道分別進行定量分析,因此需要通過液相色譜分離。本研究比較了不同流動相組成及其配比,最終選擇以0.1％甲酸的甲醇-乙腈（1∶1,V/V）混合液作為有機相,含0.1％甲酸作為水相,進行梯度洗脫,均達到了基線分離（見圖1）。

對于10種分子質量相同的COPs,不同離子對的靈敏度不同,20α-羥基膽固醇、25-羥基膽固醇、19R-羥基膽固醇、22R-羥基膽固醇和22S-羥基膽固醇的離子對367.3＞81.0響應最高且基質干擾較小,而膽甾烷-3,5,6-三醇,7α-羥基膽固醇、7β-羥基膽固醇、膽固醇5α,6α-環氧化物、膽固醇5β,6β-環氧化物和7-酮基膽固醇的離子對385.3＞367.2的響應最高,以此為定量離子對。

圖1 11種COPs和d7-7α-OH的MRM圖Fig.1 MRM chromatograms of mixed standard of 11 COPs and d7-7α-OH

3.2 酶解前處理方法的優化

3.2.2 沉淀劑和提取試劑的選擇用乙腈與乙醇作為沉淀劑分別進行沉淀劑加入體積的優化,當加入乙腈的量與緩沖液的比例為1∶2的時候,沉淀效果最好,提取效率最高。同時優化了提取試劑的組成與配比,當提取溶劑為正己烷時,提取的樣品溶液最為干凈,基質效應最小,但膽甾烷-3,5,6-三醇（Tri-OH）的回收率低于40％,當逐漸增大提取溶劑中的乙醚比例時,Tri-OH的回收率也隨之增高,最終選擇正己烷/乙醚混合液（80∶20,V/V）作為提取試劑。

圖2 酶解時間的優化Fig.2 Optimization ofenzymolysis time

3.3 酶解法方法學驗證

3.3.1 標準曲線線性與定量限根據樣品中COPs含量分別建立20,50,100,200,400,800, 1200 ng/mL和0.2,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5和3.5μg/mL系列標準曲線,以3.1節中的色-質譜法檢測,結果顯示,11種COPs在20～1200 ng/mL和200～3500 ng/mL范圍內線性關系良好,且相關系數均≥0.996。根據樣品基質中10倍信噪比的信號濃度作為定量限,得到不同的COPs的定量限,見表2。

表2 標準曲線線性與定量限Table 2 Linear range and LOQ

3.3.2 加標回收率和日內日間精密度針對蛋黃中COPs的含量,分別以低中高3個濃度水平進行加標回收實驗,每個濃度水平每天平行取樣測定6份,共測定4天,加標回收率在79.32％～104.12％之間,日內RSD在1.1％～13.8％之間,日間RSD在2.0％～12.9％之間,見表3。

表3 COPs回收率和精密度Table 3 Recovery and RSD of COPs

續表3（Continued to Table 3）

3.4 3種前處理方法的比較

將本法與皂化法和提取法測得值進行對比,皂化法和提取法分別參照文獻[22,26]進行,以酶解法所測得樣品中COPs含量為基準,就樣品中含有的7種COPs的測定結果進行作圖比較,由圖3可見,在皂化法中除了Tri-OH和7-Keto以外的5種COPs的測量值與酶解法接近,范圍在94.05％～107.49％之間。Tri-OH所測值偏低的原因主要是因為皂化法使用正己烷提取,而Tri-OH極性較大,正己烷對Tri-OH的提取率不高；7-Keto所測值偏低是因為在堿性條件下容易被破壞降解成其它物質,導致測定結果偏低。直接提取法與酶解法相比,主要區別在于5β,6β-Expo和5α,6α-Expo化合物檢測值偏低,這是因為直接提取法未完全提取出脂質中結合的COPs,而在酶解法中由于脂肪得到酶解,使膽固醇環氧化物可以釋放出來,酶解法測定值高于提取法。因此,通過比較3種方法可以得出,相比于皂化法和提取法,酶解法具有更高的提取效率,是一種較為理想的前處理方法。

圖3 3種前處理方法的比較Fig.3 Comparison of three pretreatmentmethods

3.5 方法應用

3.5.1 咸鴨蛋腌制過程中的COPs含量變化檢測分別檢測不同腌制時間的咸鴨蛋中COPs含量,結果表明,隨著腌制時間的增加,咸鴨蛋黃中的環氧化物的含量先增加后降低,在15～20天之間的COPs總含量達到最高。COPs的總量變化趨勢與環氧化物的含量變化基本一致。其它幾種COPs含量在腌制過程中基本不變,檢測的結果見表4。

“不好說。”老福摁滅了煙頭和善地說：“所以我們要搞清楚事情的真相，給你們包括你死去的姑媽一個滿意的答復。”

3.5.2 市售咸鴨蛋的檢測選取市場上銷售的11種咸鴨蛋,按2.2制樣后使用本方法進行檢測,咸鴨蛋黃中檢出了7α-羥基膽固醇、7-酮基膽固醇、膽固醇5α,6α-環氧化物、膽固醇5β,6β-環氧化物和膽甾烷-3,5,6-三醇等7種COPs,未檢出22R-羥基膽固醇、20α-羥基膽固醇、25-羥基膽固醇和22S-羥基膽固醇,同時發現咸鴨蛋中的COPs總量相差較大,最高值達到85.876μg/g,是最低值的2.5倍。這可能與腌制工藝以及儲存方式有關,值得進一步研究。

表4 腌制過程中咸鴨蛋COPs含量變化Table 4 Variation of COPs content in salted eggs in the process of sousing（n=3）

4 結論

將酶解法結合固相萃取作為前處理,建立了UPLC-APCI-MS/MS準確測定咸鴨蛋黃中11種COPs的方法。對比了酶解法、皂化法和提取法,驗證了酶解法的提取完全性和準確性。利用本方法比較了傳統腌制咸鴨蛋過程鴨蛋黃中的COPs變化,對11份市售的咸鴨蛋中COPs含量進行測定,檢出7種COPs,并發現在不同的樣品中含量差別明顯,為進一步研究腌制工藝及儲存方式對咸鴨蛋黃中的COPs含量變化提供了一種可靠的分析方法。

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（Received 23 June 2015；accepted 6 September 2015）

This work was supported by the Research Project for Application of the Public welfare Technology,Zhejiang Province（No.2015C37061）

Simultaneous Determ ination of 11 Cholesterol Oxidation Products in Salted Duck Egg Yolk by Enzymolysis-Liquid Chromatography Tandem M ass Spectrometry

KE Xing1,HUANG Bai-Fen*2,LüMei-Ling3,MOWei-Min*1,REN Yi-Ping21（College ofChemical Engineering；Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China）
2（Zhejiang Center for Disease Control and Prevention,Hangzhou 310051,China）
3（Agilent technologies Co.,LTD in China,Beijing 100102,China）

A method for simultaneous quantification of 11 cholesterol oxidation products（COPs）in yolk of salted duck egg was developed by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLCMS/MS）with enzymatic treatment.Firstly,the yolk of salted duck egg was digested by lipase at 37℃,and COPswere extracted by n-hexane and diethyl ethermixture（8∶2,V/V）.The supernatant was enriched and purified by solid phase extraction of silica.Eleven COPswere separated by UPLCHSST3 column（100mm× 2.1 mm,0.3μm）with water and methanol/acetonitrile（1∶1,V/V）both containing 0.1％formic acid.All COPswere simultaneously determined by UPLC-MS/MSwithmultiple reactionmonitoringmode（MRM）.The d7-7α-OH cholesterol was used as internal standard.The results showed that the linear ranges were 20-1200 ng/mL and 200-3500 ng/mL with correlation coefficient（r≥0.996）.The recoveries of three spiking levelswere between 79.3％and 104.1％,and relative standard deviations（RSD）were 2.0％and 12.9％.The limit of quantification（LOQ）was 0.08-0.40μg/g.The established method with good repeatability and robust recovery can be applied to quantify the levels of11 COPs in yolk of salted duck eggs.

Cholesterol oxidation products；Salted duck egg yolk；Enzymaticmethod；Liquid chromatography tandem mass spectrometry

10.11895/j.issn.0253-3820.150514

2015-06-23收稿；2015-09-06接受

本文系浙江省公益性技術應用研究計劃（No.2015C37061）資助