基于聚吡咯-銦錫氧化物微電極的細胞阻抗生物傳感器構建及細胞生物學行為信息檢測

李遠袁國林夏春勇于超（重慶醫科大學生命科學研究院,重慶40006）（重慶醫科大學附屬永川醫院,永川4060）

基于聚吡咯-銦錫氧化物微電極的細胞阻抗生物傳感器構建及細胞生物學行為信息檢測

李遠1,2袁國林1夏春勇1于超*11（重慶醫科大學生命科學研究院,重慶400016）2（重慶醫科大學附屬永川醫院,永川402160）

采用光刻技術蝕刻感光干膜絕緣層制備銦錫氧化物（ITO）微電極,采用循環伏安法在ITO微電極表面電沉積聚吡咯（PPy）膜制備PPy-ITO微電極。用電化學阻抗譜技術考察PPy膜厚度對PPy-ITO微電極阻抗特征的影響,人肺癌細胞株A549粘附增殖實驗考察PPy-ITO電極細胞生物相容性。以PPy-ITO微電極為傳感電極,通過電化學阻抗譜技術和等效電路擬合技術對A549細胞粘附增殖及上皮間充質轉變（EMT）過程進行檢測和分析。結果表明,與裸ITO微電極相比,在最優參數下制備的PPy-ITO微電極（電沉積5個循環）具有更優的電化學阻抗性質和細胞生物相容性。基于PPy-ITO微電極的細胞阻抗生物傳感器能夠解析A549細胞粘附增殖及EMT過程中細胞質膜電容、細胞-細胞間隙電阻、細胞-聚吡咯膜間隙電阻變化檢測。

生物傳感器；電化學阻抗譜；聚吡咯；銦錫氧化物

1 引 言

細胞阻抗生物傳感器是一類以固定在電極表面的活細胞作為敏感原件,以電化學阻抗譜檢測細胞響應行為的生物傳感器[1]。由于細胞阻抗生物傳感器能夠無標記、定量地分析細胞粘附、增殖、凋亡等生物學行為[2～4],在藥物篩選[5]、毒物測試[6]及細胞生理病理機制研究[7]等領域具有潛在應用價值。在細胞阻抗生物傳感器研究中,電極表面的細胞固定與活性保持是細胞對外界刺激響應的基礎,因此構建兼具細胞生物相容性和導電性的傳感電極是其研究的關鍵。

當前,細胞阻抗生物傳感器的傳感電極常采用惰性金屬導電材料,如金[8]、鉑[9]或銦錫氧化物[10],生物相容性較差,采用新型生物材料進行表面修飾是改善電極細胞生物相容性的重要方法[11]。聚吡咯作為一種共軛導電聚合物,具有本征導電性、表面性質可控、穩定性好及低電位聚合制備等優點,可作為電化學生物傳感器[12]的電極修飾材料。此外,聚吡咯膜還是一種重要的組織工程材料[13]和神經探針電極修飾材料[14],可為神經細胞[15]、內皮細胞[16]、心肌細胞[17]等提供粘附與增殖位點。Ding等在ITO電極表面修飾了碳納米管摻雜的聚吡咯納米復合膜,證實該復合物界面適宜細胞粘附和增殖,通過電化學阻抗譜技術檢測了ECA-109細胞的粘附和增殖[18]。Ateh等利用聚吡咯修飾的金電極進行細胞阻抗檢測,結果表明,聚吡咯修飾電極能夠提高傳感器檢測靈敏度[19]。然而,上述報道的細胞阻抗生物傳感器采用大尺寸傳感電極,通過檢測溶液中氧化還原探針電子轉移阻抗的變化實現電極表面上細胞數量的檢測,未能進一步分析細胞生物學過程行為學信息。本研究構建了ITO微電極,研究了聚吡咯修飾在改善電極本征阻抗特征和細胞生物相容性方面的作用。以PPy-ITO微電極為傳感電極,在無氧化還原探針情況下通過電化學阻抗譜技術對人肺癌細胞株A549粘附增殖和EMT過程進行檢測,利用等效電路擬合技術解析上述過程中細胞質膜電容、細胞-細胞間隙電阻、細胞-聚吡咯膜間隙電阻的變化。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CS315電化學工作站（武漢科斯特儀器有限公司）；Varioskan Flash多功能酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；Veeco MultimodeⅧ原子力顯微鏡（瑞士Veeco公司）；IX71倒置光學顯微鏡（奧林巴斯公司）。ITO導電玻璃（珠海凱為光電科技有限公司）,面電阻≤7Ω/mm2,用丙酮、無水乙醇、去離子水超聲清洗15min,烘干待用。HF90二氧公碳細胞培養箱（力康生物醫療科技集團）；離心機（德國Eppendorf公司）。

吡咯單體（Sigma-Aldrich公司）,氮氣保護蒸餾,-20℃儲存；硫酸葡聚糖（Dextran Sulfate,DS,Sigma-Aldrich公司）；轉化生長因子-β1（TGF-β1,以色列Prospec公司）。其它試劑均為分析純。實驗用水為去離子水（≥18 MΩcm）。CCK-8分析液、異硫氰酸熒光素標記鬼筆環肽（江蘇省海門碧云天生物技術公司）。人肺癌上皮細胞A549在含10％胎牛血清（杭州四季青）、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPIM-1640培養液（Gibco）中,37℃,5％CO2條件下培養；待細胞生長至對數生長期,用0.25％胰酶（含0.02％EDTA）消化細胞,1500 r/min離心4min,收集細胞。

2.2 ITO微電極加工及聚吡咯膜電化學沉積

ITO微電極采用光刻技術對感光干膜絕緣層蝕刻而成：將一層感光干膜（HQ-6100,感光層厚度為35μm,長興化學工業股份有限公司）通過覆膜機 （100℃）壓貼在ITO導電玻璃表面（6.0 cm× 2.5 cm）,透過掩膜膠片對感光干膜紫外光照射30 s,30℃下用1％Na2CO3溶液對感光干膜顯影5min,使未經紫外光照射區域的感光干膜溶解露出ITO電極,去離子水沖洗2次,60℃烘干,紫外光照射60 s,使感光膠完全固化。ITO微電極直徑為1.0 mm,如圖1a所示。

電化學小池裝置結構示意圖如圖1b所示,ITO微電極和測量小池用塑料夾具固定,使ITO微電極置于測量小池底部,整個裝置含4個獨立的測量小池,每個小池直徑為8mm,體積為500μL。聚吡咯膜電沉積采用電化學循環伏安法,以ITO微電極為工作電極,以Ag/AgCl絲（10 mm×0.5 mm）和鉑絲（10 mm×0.1 mm）分別作為參比電極和輔助電極,如圖1c所示。聚合溶液含0.1 mol/L吡咯單體和1mg/mL硫酸葡聚糖（DS）,聚合電壓設為0～0.7 V（vs.Ag/AgCl）,掃描速度20 mV/s,膜厚度通過循環數控制。用原子力顯微鏡對聚吡咯模形貌進行表征。

圖1 氧化銦錫（ITO）微電極（a）,和電化學測量池裝置結構示意圖（b）、實物圖（c）Fig.1 Indium tin oxide（ITO）microelectrode（a）,structure diagram（b）,picture of electrochemical cells（c）

2.3 聚吡咯膜細胞生物相容性研究

ITO電極上電沉積的聚吡咯膜細胞的生物相容性通過細胞粘附與增殖行為進行評價。按上述相同聚合參數,在直徑6 mm ITO電極上沉積聚吡咯膜,70％乙醇浸泡30min消毒,無菌去離子水沖洗,干燥待用。將100μL A549細胞懸液以濃度為5.0×104cells/mL接種在電化學測量小池內,放入細胞培養箱,靜置2 h,使細胞在小池底部聚吡咯表面粘附與鋪展。以裸ITO電極、玻璃和細胞培養皿材料聚苯乙烯做對照實驗。細胞顯微形態學通過倒置光學顯微鏡觀察,CCD相機獲取細胞粘附和鋪展的相差顯微圖像。

細胞在聚吡咯膜上的增殖行為通過Cell Counting Kit（CCK-8）實驗評價。將100μL A549細胞懸液（2.0×104cells/mL）分別接種在含聚吡咯膜的測量小池和傳統聚苯乙烯96孔板內,細胞培養箱中培養24和48 h,隨后加入10μL CCK-8分析液,輕搖混勻,37℃孵育2 h,分別取測量小池和96孔板內溶液100μL,用多功能酶標儀測定450 nm處的吸光度。

2.4 PPy-ITO微電極上細胞粘附增殖生物學行為電化學阻抗檢測

將100μL A549細胞懸液以濃度為2.0×104cells/mL加載到PPy-ITO微電極的測量小池內,室溫條件下靜置30min,使細胞均勻沉降到PPy-ITO微電極表面,隨后放入細胞培養箱中分別培養2,24和48 h,PBS沖洗除去死細胞及未粘附細胞,隨后將輔助電極和參比電極插入測量小池進行電化學阻抗譜測量。實驗以未加載細胞的PPy-ITO微電極作為對照組。電化學阻抗譜測量以0.01mol/L PBS作為支持電解質溶液,開路電壓下對電極施加幅值為10 mV的正弦波交流檢測信號,頻率掃描范圍為1～105Hz,阻抗譜數據用ZView 2.0軟件（Scribner Associates,Southern Pines,NC,USA）建立等效電路擬合分析。

2.5 TGF-β1誘導A549細胞上皮間充質轉變（EM T）生物學行為電化學阻抗分析

將100μL 1.0×106cells/mL A549細胞懸液加載到含PPy-ITO傳感電極的測量池內,室溫下靜置30min,放入細胞培養箱培養24 h,A549細胞在傳感電極上增殖形成細胞單層。再將測量小池內細胞培養液換成含10 ng/mL轉化生長因子-β1（TGF-β1）培養液,以未加入TGF-β1的培養液為對照,分別培養12,24和36 h后測量電化學阻抗譜。A549細胞骨架用異硫氰酸熒光素標記鬼筆環肽進行熒光染色。

3 結果與討論

3.1 PPy-ITO微電極加工

電化學循環伏安法聚合聚吡咯膜的循環伏安曲線如圖2a所示。隨著掃描圈數增加,氧化電流增大,說明聚吡咯膜成功沉積在ITO微電極表面,且提高了電極的導電性和電化學活性。圖2b為電沉積5個循環的聚吡咯膜AFM圖像,可以看出電沉積在ITO微電極表面的聚吡咯膜由直徑約為50 nm均勻粒子組成,表面粗糙度為（12.54±0.36）nm（n=3）。

圖2 ITO微電極表面上電化學循環伏安法沉積聚吡咯膜.（a）循環伏安曲線.（b）聚吡咯膜AFM圖片Fig.2 Electropolymerization of polypyrrole（PPy）on the surface of ITO microelectrode by electrochemical cyclic voltammetry.（a）Cyclic voltammogram.（b）AFM image of PPy film

3.2 PPy-ITO微電極電阻抗特性表征及PPy膜厚度優化

圖3a為ITO微電極和PPy-ITO微電極電化學阻抗譜。在1～103Hz掃描頻率范圍間,PPy-ITO微電極阻抗幅值低于ITO微電極阻抗幅值,其原因在于聚吡咯膜電沉積,使電極表面粗糙度和表面積增加,表面雙分子層電容增大,電極阻抗值降低[20]。在1～104Hz掃描頻率范圍,PPy-ITO微電極相位角低于ITO微電極,說明PPy-ITO微電極比ITO微電極更趨向電阻性質。其原因在于聚吡咯表面粗糙,且包含大量的空隙,電解質滲入空隙內,使得電極具電阻特征[20]。PPy-ITO微電極的低阻抗幅值和電阻特征有利于提高傳感器檢測靈敏度[21]。圖3b為沉積不同循環圈數PPy-ITO微電極阻抗幅值頻率曲線。結果表明,PPy-ITO微電極阻抗隨電沉積循環圈數增加而降低。此結果與文獻[20]報道的電極阻抗隨聚吡咯聚合時間延長而降低的結論一致。圖3c為電沉積不同循環數的PPy-ITO微電極放大圖像,可見聚吡咯膜均勻沉積在ITO微電極表面,且隨著電沉積循環次數增加,聚吡咯膜厚度增大,顏色變深。當電沉積循環圈數增加至6及以上,聚吡咯膜表面張力增大,容易發生褶皺,并從ITO微電極上脫落。因此,后續實驗選擇電沉積循環5圈制備PPy-ITO微電極。

3.3 PPy-ITO電極細胞生物相容性評價

由不同基底上接種A549細胞2 h后細胞粘附和鋪展的顯微形態圖片（圖4a）可見,聚吡咯膜上粘附的A549細胞均開始鋪展,而ITO電極表面和玻璃表面的A549細胞仍呈圓形,幾乎不見鋪展的細胞。同時,聚苯乙烯表面上A549細胞也開始鋪展,但鋪展細胞比例小于聚吡咯膜。上述結果說明,PPy-ITO電極更有效地促進A549細胞的粘附和鋪展,有利于細胞在電極表面固定。圖4b為在PPy-ITO電極表面培養24和48 h時A549細胞的相對增殖率。結果表明,在PPy-ITO電極表面培養的細胞相對增殖率高于聚苯乙烯基底,這也說明PPy-ITO電極能促進A549細胞增殖,具有優異的細胞生物相容性。

圖3 （a）ITO微電極和PPy-ITO微電極電化學阻抗譜.（b）聚合循環數分別為1～10時的PPy-ITO微電極的阻抗頻率曲線.（c）PPy-ITO微電極顯微圖像Fig.3 （a）Electrochemical impedance spectra of ITO and PPy-ITO microelectrodes.Impedance spectrocopy （b）and microscopy images（c）of PPy-ITOmicroelectrodeswith different electrodepositon cycle numbers from one to ten

圖4 PPy-ITO電極細胞生物相容性評價.（a）A549細胞接種2 h時的相差顯微鏡圖像.（b）A549細胞在PPy-ITO電極上相對細胞增殖活性.實驗以聚苯乙烯基底上接種A549細胞24 h時活性作為對照。Fig.4 Cell biocompatibility evaluation of PPy-ITO electrode.（a）Phase contrastmicroscopy images of A549 cells after inoculated for 2 h.（b）Relative viability of A549 cells cultured on PPy-ITO.The viability of A549 cells after cultured on polystyrene substrate for 24 h was used as control

3.4 PPy-ITO微電極上細胞粘附增殖行為的電化學阻抗譜表征

由A549細胞接種在PPy-ITO微電極上不同時刻對應的電化學阻抗譜復平面圖（圖5a）可見,A549細胞在PPy-ITO微電極上的粘附和增殖導致電極阻抗譜高頻部分的半圓特征發生改變,且隨著細胞增殖,半圓直徑增大,說明電極界面上的細胞增殖導致電子轉移過程速度減慢,其原因可能與細胞質膜電容充電效應有關[19]。另外,在低頻區域,A549細胞的增殖未對電極阻抗譜產生明顯變化。圖5b為對照PPy-ITO微電極的阻抗譜復平面圖,其高頻區域半圓特征未發生明顯改變。上述結果說明了圖5a中高頻區半圓直徑的變化是由細胞粘附與增殖引起的。

PPy-ITO微電極等效電路模型采用含Warburg元件和常相位元件（CPE）的Randles電路[22],利用該電路對0h的PPy-ITO微電極阻抗譜進行非線性最小二乘曲線擬合,獲得PPy-ITO微電極等效電路模型中各元件初始值（圖5c）。細胞等效電路由一個RC并聯電路和一個R元件串聯組成[22]。其中,Rs′為細胞-電極的間隙電阻,Rcell為細胞-細胞電阻,Ccell為細胞質膜的電容效應。將圖5a的電化學阻抗譜數據與圖5c的等效電路模型擬合,細胞增殖不同時刻的等效電路各元件擬合結果如圖5d所示。結果表明,Ccell在2～24 h快速增加,24 h后趨于穩定,約為8.7 nF,此數值變化與細胞粘附增殖過程中細胞厚度降低、鋪展面積增大、細胞離子通道數量和開閉有關[23]。此外,細胞的Rcell值和Rs′值均持續增加,形成細胞單層時（48 h）,Rcell≈1655Ω,Rs′≈268Ω。Rcell值持續增加說明細胞-細胞間的間隙逐漸縮小,細胞融合度增加[24]；Rs′值增加則提示細胞與PPy-ITO電極間間隙縮小,細胞粘附強度增強[24]。

圖5 PPy-ITO微電極上細胞粘附增殖行為的電化學阻抗譜檢測。（a）接種A549細胞0,2,24和48 h 時PPy-ITO微電極典型的阻抗譜復數平面圖；（b）未接種細胞的PPy-ITO微電極典型阻抗譜復數平面圖；（c）PPy-ITO微電極等效電路模型（左）和細胞等效電路模型（右）串聯；（d）PPy-ITO微電極上接種A549細胞不同時刻的細胞等效電路模型各元件值擬合值（n=3）Fig.5 Cell adhesion and proliferation behaviors on PPy-ITO microelectrode measured by electrochemical impedance spectroscopy.（a）Typical electrochemical impedance spectra of PPy-ITO microelectrodes recorded at0,2,24 and 48 h after inoculation of A549 cells；（b）Typical electrochemical impedance spectra of PPy-ITOmicroelectrodeswithout cells inoculation；（c）Equivalent circuitmodel of PPy-ITO microelectrode（left）and Equivalent circuitmodel of cell（right）in series；（d）Curve fit results for the equivalent circuitmodel of A549 cells after inoculation on PPy-ITOmicroelectrodes at different time interval（n=3）

3.5 PPy-ITO微電極測量TGF-β1誘導A549細胞的上皮間充質轉變（EM T）生物學過程

圖6a為TGF-β1誘導A549細胞36h后細胞骨架熒光染色圖像。結果顯示,對照組A549細胞呈典型的鵝卵石樣上皮形貌,而實驗組A549細胞形態更趨向呈纖維梭狀細胞樣,細胞間連接變弱,應力纖維增加。此結果與文獻[25]相符,證實A549細胞在TGF-β1誘導作用下成功發生EMT過程。圖6b為A549細胞EMT過程中不同時間點細胞等效電路元件值變化曲線,TGF-β1處理12 h時,實驗組Ccell低于對照組Ccell；在24和36 h時,實驗組Ccell高于對照組Ccell,證明腫瘤細胞EMT過程中出現的細胞膜波動、細胞面積增大和細胞應力纖維增加等形態學變化[25]。此外,實驗組Rs′和Rcell值均比對照組Rs′和Rcell值低,且隨著TGF-β1處理時間延長,差值增大。實驗組Rs′降低提示細胞與基底間間隙增大,粘附力減低,此結果與文獻[26]的實驗結果（細胞EMT過程細胞與基底間粘附力降低）吻合。Rcell值降低則提示細胞-細胞間連接變弱,這與A549細胞EMT過程細胞連接蛋白E-鈣黏著蛋白表達減低有關[25]。

圖6 （a）A549細胞的細胞骨架熒光染色圖片.（b）TGF-β1處理A549細胞不同時刻細胞等效電路模型各元件值擬合值（n=3）Fig.6 （a）Cytoskeletion fluorescence images of A549 cells.（b）Curve fit results for the equivalent circuit model of A549 cell after treatmentwith TGF-β1 for different time

4 結論

采用光刻技術制備ITO微電極,在ITO微電極表面電沉積PPy膜制備PPy-ITO微電極。通過電化學阻抗譜技術和等效電路擬合技術對微電極表面上的A549細胞粘附增殖及EMT過程進行檢測分析。結果表明,PPy-ITO微電極具有優良的電化學阻抗特性和細胞生物相容性,基于此電極構建的阻抗生物傳感器可對細胞生物學行為信息進行檢測。

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（Received 14 May 2015；accepted 25 August2015）

This work was supported by the Natural Science Foundation Project of CQ CSTC（cstc2012jjA10046）,Innovation Ability Platform Project of Yongchuan District（Ycstc,2014bf5001）and the Key Research Project of Yongchuan Hospital,Chongqing Medical University（YJZD201302）

Construction of a Cell Im pedance Biosensor Based on Polypyrrole-Indium Tin Oxide M icro-Electrode for Detecting Cell Biology Behavior

LIYuan1,2,YUAN Guo-Lin1,XIA Chun-Yong1,YU Chao*11（Institute of Life Sciences,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China）
2（Central Laboratory of Yongchuan Hospital,Chongqing Medical University,Yongchuan 402160,China）

An indium tin oxide（ITO）microelectrode was fabricated by etching the insulating layer of photosensitive dry film using lithography technology,then polypyrrole（PPy）layer with different thicknesswas electrodeposited on the surface of the ITOmicroelectrode by electrochemical cyclic voltammetry to get PPy-ITO microelectrode.The effect of the thickness of PPy layer on the impedance characteristic of PPy-ITO microelectrode was examined by electrochemical impedance spectroscopy（EIS）.The biocompatibility of the PPy-ITOmicroelectrodeswas investigated by adhesion and proliferation experiment of human lung cancer cell A549.Finally,using PPy-ITO microelectrode as sensing electrode,biology information on the adhesion, proliferation and epithelial-mesenchymal transition（EMT）of A549 was tested and analyzed by EIS and equivalent circuit fitting.The results showed that the PPy-ITO microelectrode prepared under optimal parameter（electrodeposition for five cycles）had a lower electrical impedance and a better cell compatibility than bare ITOmicroelectrode.The changes of cytoplasm membrane capacitance,intercellular resistance and the gap resistance between cell and polypyrrole film during the processes of adhesion,proliferation and epithelial-mesenchymal transition（EMT）of A549 could be detected by a cell impedance biosensor based on the PPy-ITOmicroelectrode.

Biosensor；Electrochemical impedance spectroscopy；Polypyrrole；Indium tin oxide

10.11895/j.issn.0253-3820.150396

2015-05-14收稿；2015-08-25接受

本文系重慶市科委自然科學基金計劃資助項目（cstc2012jjA10046）；重慶市永川區創新能力建設平臺項目（Ycstc,2014bf5001）；重慶醫科大學附屬永川醫院院級重點研究項目（YJZD201302）資助

E-mail：yuchaom@163.com