量子點熒光微球免疫層析試紙條定量檢測玉米中赭曲霉毒素A

周耀鋒熊斯誠江 湖,段 宏,熊勇華,Andrew Wang（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,南昌大學(xué),南昌0047）（中德聯(lián)合研究院,南昌大學(xué)南昌,0047）（Ocean NanoTech,LLC.,San Diego,CA96 USA）

量子點熒光微球免疫層析試紙條定量檢測玉米中赭曲霉毒素A

周耀鋒1熊斯誠1江 湖1,2段 宏1,2熊勇華*1,2Andrew Wang31（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,南昌大學(xué),南昌330047）2（中德聯(lián)合研究院,南昌大學(xué)南昌,330047）
3（Ocean NanoTech,LLC.,San Diego,CA92126 USA）

采用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC）法將抗赭曲霉毒素A（OTA）腹水與量子點熒光微球偶聯(lián)制備熒光探針,以牛血清白蛋白-OTA偶聯(lián)物及驢抗鼠二抗噴涂硝酸纖維膜形成試紙條檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）,建立了基于T/C熒光強度（FIT/FIC）比值法免疫層析試紙條高靈敏度、快速定量檢測玉米中OTA的新方法。量子點熒光微球試紙條定量檢測OTA線性范圍為0.05～1.0 ng/mL（Y=0.259ln X+ 0.897,R2=0.995）,半數(shù)抑制濃度（IC50）為（0.215±0.023）ng/mL（n=5）,玉米提取液中OTA的檢出限為0.05 ng/mL,單個樣品檢測時間10min。加標(biāo)回收實驗表明,3個OTA加標(biāo)濃度的平均回收率為107.2％ ～125.5％,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10％。40個實際玉米樣品檢測結(jié)果表明,量子點熒光微球試紙條與酶聯(lián)免疫吸附分析方法檢測OTA的結(jié)果具有良好的相關(guān)性（R2=0.975）。

量子點熒光微球；免疫層析試紙條；赭曲霉毒素A；定量檢測

1 引 言

赭曲霉毒素是由赭曲霉（Aspergillus ochraceors）、疣孢青霉（Pmicilium vermculosutm）、純綠青霉（Penicilium viridicatum）和其它幾種青霉屬真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer,IARC）將赭曲霉毒素A（OTA）定位為2B類致癌物[1]。OTA常污染小麥、玉米、谷類、咖啡以及葡萄等[2],建立靈敏、快速的檢測方法是有效防止受OTA污染的生產(chǎn)原料進(jìn)入人類食物鏈的有效措施之一。

基于免疫學(xué)的快速篩查方法因具有通量高、檢測快速、成本低等優(yōu)勢,近年來得到廣泛的推廣和應(yīng)用。已報道的OTA免疫學(xué)（或適配體）篩查方法包括酶聯(lián)免疫法[3]、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法[4]、時間分辨熒光免疫分析法[5]、熒光偏振免疫分析法[6]、基于核酸適配體的生物傳感器法[7]及膠體金免疫層析試紙條法[8,9]等。膠體金免疫層析試紙條法因具有檢測速度快、抗基質(zhì)干擾能力強、操作簡單、無需復(fù)雜儀器等優(yōu)勢,是現(xiàn)場快速篩查的首選方法[10,11]。與傳統(tǒng)膠體金標(biāo)記物相比,熒光標(biāo)記物具有更高的檢測靈敏度,適用于定量分析[12]。基于熒光標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)近年來得到了廣泛關(guān)注,有機(jī)染料是免疫層析檢測技術(shù)常用的熒光標(biāo)記物[13]。與傳統(tǒng)有機(jī)染料相比,量子點具有激發(fā)光譜寬且分布連續(xù)、發(fā)射光譜窄而對稱、顏色可調(diào)、耐光漂白、熒光壽命長等優(yōu)點,是一種極具潛力的新型熒光標(biāo)記材料[14]。量子點微球（Quantum dot submicrobeads,QBs）通過將大量的量子點包裹于聚合物材料中,表現(xiàn)出更高的熒光強度,并且提高了量子點的光學(xué)穩(wěn)定性。本實驗室前期以QBs為新型熒光標(biāo)記物,建立了免疫層析試紙條定量檢測血清中惡性瘧原蟲的新方法,檢測靈敏度較傳統(tǒng)膠體金試紙條方法提高了約10倍[15]。本研究以羧基化修飾的QBs為載體,將抗OTA腹水直接標(biāo)記至微球表面,制備了新型熒光探針,建立了熒光免疫層析試紙條高靈敏快速地定量檢測玉米中OTA的新方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

XYZ3000點膜儀（BIO-DOT公司）；自動切條機(jī)（金標(biāo)生物科技公司）；便攜式熒光試紙條讀取儀（上海互幗科學(xué)儀器有限公司,光電倍增管接收最佳熒光發(fā)射波譜范圍為580～620 nm）；硝酸纖維膜（NC膜）、結(jié)合墊、吸水紙和PVC底板（美國Millipore公司）。

表面羧基化修飾的CdTe/ZnSe量子點聚合物微球（QBs,由Ocean Nanotech公司贈送）,平均粒徑為255 nm,熒光最大發(fā)射波長為620 nm；驢抗鼠二抗（北京中山生物科技公司）；牛血清白蛋白（BSA）、鼠抗OTA腹水、OTA酶聯(lián)免疫試劑盒（無錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司）；OTA標(biāo)準(zhǔn)品（北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）,均購于Sigma公司；其它試劑均為分析純。實驗用水為超純水（18.2 MΩcm）。經(jīng)LC-MS方法確證為無OTA污染的玉米樣品購于山東、江西等地的集貿(mào)市場。

2.2 抗OTA抗體標(biāo)記的QBs探針制備

采用EDC·HCL一步法將腹水中抗OTA單克隆抗體上氨基與QBs上羧基進(jìn)行偶聯(lián)[14]：將1.0 mg QBs,170μg EDC·HCl與30 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.0,0.01 mol/L）混勻后,立即加入150μg鼠抗OTA腹水,1 h補加一次相同劑量EDC·HCl,室溫攪拌反2 h后,反應(yīng)液以12000 g離心10min,超純水洗滌沉淀一次,再次離心,收集沉淀復(fù)溶于6.5 mL復(fù)溶液（pH 7.4,0.01 mol/L PBS,含2％果糖、1％聚乙二醇、5％蔗糖、1％BSA、0.4％吐溫-20）中,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 OTA檢測抗原的制備

取1 mg OTA溶解于500μL無水四氫呋喃中,加入2mg NHS和4 mg DCC,室溫避光反應(yīng)60min；10000 g離心15min,棄沉淀,氮氣吹干,殘留物溶于200μL二甲基甲酰胺中得OTA活化產(chǎn)物。將活化產(chǎn)物緩慢滴加于BSA溶液中（0.13 mol/L NaHCO3溶液）,其中OTA與BSA投料比為5∶1；室溫避光劇烈振蕩90min,將反應(yīng)產(chǎn)物在0.01 mol/L PBS溶液中透析72 h；透析物（OTA-BSA）分裝,于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 QBs熒光試紙條的制備

熒光試紙條包括樣本墊、NC膜、吸水紙及PVC底板的4部分。首先將樣本墊浸泡于20mmol/L硼酸鹽緩沖液（pH 8.0,含1.0％BSA,0.25％Tween-20和0.1％NaN3）中,于60℃干燥2 h；將不同濃度OTA-BSA偶聯(lián)物（3.5,3.0及2.5mg/mL）和驢抗鼠多抗（0.3mg/mL）噴涂于NC膜上,分別作為OTA試紙條檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）,于37℃干燥12 h；最后將吸水紙、NC膜和經(jīng)過預(yù)處理的樣本墊順序粘貼在PVC底板上,用自動切條機(jī)切成4 mm寬的試紙條,室溫下干燥,備用。

2.5 QBs熒光試紙條定量檢測玉米中OTA

2.5.1 玉米樣品前處理取5 g玉米樣品粉碎,稱取1 g玉米粉加入4 mL磷酸鹽緩沖液（PBS, pH 7.0,0.01 mol/L,內(nèi)含50％甲醇）,渦旋提取5min后,超聲處理10min；10000 g離心10min,取上清液加入4倍體積PBS緩沖液（1.0 mol/L NaCl）稀釋提取液至甲醇濃度10％,NaCl濃度為0.8 mol/L。

2.5.2 檢測OTA的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線取經(jīng)LC-MS確證為不含OTA的玉米樣品,按2.5.1節(jié)進(jìn)行前處理后的提取液中添加OTA標(biāo)準(zhǔn)品,制備OTA系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（0,0.025,0.05,0.10,0.25,0.50,0.75及1.00 ng/mL）。取OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液上熒光試紙條檢測,記錄試紙條T線和C線熒光強度（FIT,FIC）以及T/C線熒光強度比值（FIT/FIC）,每個標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測5次。以O(shè)TA濃度對數(shù)為橫坐標(biāo),OTA競爭抑制率（1-B/B0）為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中B為不同OTA濃度下試紙條FIT/FIC,B0為OTA為陰性時試紙條的FIT/FIC。將獲得的OTA定量標(biāo)準(zhǔn)曲線輸入便攜式熒光試紙條讀取儀,進(jìn)行OTA定量分析。

2.5.3 玉米中OTA定量檢測流程QBs熒光試紙條檢測原理見圖1。具體流程如下：1.25μL QBs探針與70μL玉米樣品提取稀釋液混合,室溫下孵育3min后,加入試紙條樣本墊,室溫下層析反應(yīng)10min,用熒光試紙條讀取儀讀取試紙條FIT/FIC（B）數(shù)值,讀取儀根據(jù)預(yù)存儲的定量方程自動計算實際樣本中OTA濃度,依據(jù)提取過程中樣品實際稀釋倍數(shù)即獲得玉米樣品中OTA含量。

2.6 QBs熒光試紙條性能評價

采用加標(biāo)回收實驗評價QBs熒光試紙條的準(zhǔn)確性以及精密度。具體操作如下：準(zhǔn)確稱取5 g經(jīng)LC-MS確證不含OTA的玉米粉碎樣品,分別按5,10及20μg/kg水平添加OTA標(biāo)準(zhǔn)品（500 ng/mL甲醇溶液）,室溫浸潤1 h后,按2.5.1節(jié)提取方案提取玉米中OTA,離心取上清液,調(diào)整提取液中甲醇含量至10％,NaCl濃度為0.8 mol/L,使用熒光試紙條檢測,每個樣品重復(fù)檢測5次,計算玉米樣品中OTA加標(biāo)回收率。為了評價QBs熒光試紙條的實用性,取40個實際玉米樣品,隨機(jī)添加不同濃度OTA標(biāo)準(zhǔn)品,分別采用QBs熒光試紙條以及商業(yè)化OTA酶聯(lián)免疫試劑盒檢測,兩者檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

圖1 QBs熒光試紙條檢測赭曲霉素A的原理圖Fig.1 Schematic illustration of detection of Ochratoxin A（OTA）by quantum dot beads（QBs）-based immunochromatographic strip

3 結(jié)果與討論

3.1 QBs熒光試紙條的優(yōu)化

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),QBs表面抗體飽和標(biāo)記量約為150μg/mg；采用EDC·HCl法將未純化的抗體腹水飽和標(biāo)記羧基化QBs,可大大降低QBs在NC膜上的非特異性吸附[14]。因此,本研究直接采用抗OTA腹水飽和標(biāo)記羧基化QBs,獲得抗體標(biāo)記的熒光探針。將QBs熒光探針用于T線噴涂有不同真菌毒素檢測抗原的試紙條發(fā)現(xiàn),只有噴涂OTA-BSA的試紙條T線顯示較強的熒光,其它試紙條T線均無熒光,表明抗OTA腹水飽和標(biāo)記的QBs探針具有較好的特異性。這是因為QBs上標(biāo)記上的抗OTA抗體對OTA的特異性識別；同時腹水中含有的大量雜蛋白進(jìn)一步封閉了QBs上多余羧基位點,減少了非特異性吸附。采用腹水直接標(biāo)記QBs可省去抗體純化的繁瑣過程,有利于保持抗體的生物活性。

在試紙條制備過程中,QBs探針用量及T線上檢測抗原噴涂濃度是影響試紙條檢測靈敏度的兩大關(guān)鍵參數(shù)。本實驗通過棋盤滴定實驗探討了QBs探針用量及T線上OTA-BSA噴涂濃度對試紙條陰性顯色以及檢測靈敏度的影響。從表1可知,隨著QBs熒光探針用量及T線抗原濃度的增加,試紙條T線和C線顯色強度不斷增強,符合免疫學(xué)反應(yīng)規(guī)律。當(dāng)試紙條熒光強度大于500時,在紫外燈光下試紙條熒光條帶清晰。為了保證儀器以及裸眼結(jié)果判讀的可靠性,本實驗以試紙條T線和C線熒光強度接近500為試紙條陰性顯色基本條件。從表1可知,在OTA陽性添加實驗（0.5 ng/mL）中,盡管第4組, 第7組及第8組競爭抑制率較大,但其試紙條T線和C線陰性顯色均遠(yuǎn)小于500；而第9組實驗中,當(dāng)QBs熒光探針用量為1.25μL、T線OTA-BSA抗原噴涂濃度為2.5mg/mL時,試紙條T線和C線顯色強度均約為500,且此時OTA陽性添加實驗中競爭抑制率達(dá)到了45％（0.45±0.02）,因此后續(xù)實驗選取在此條件下進(jìn)行。

3.2 QBs熒光試紙條檢測條件的優(yōu)化

免疫層析試紙條顯色是抗原抗體免疫學(xué)動態(tài)反應(yīng)過程。NC膜上T線和C線熒光強度隨反應(yīng)時間變化,可間接反映探針上標(biāo)記抗體在T線和C線上的動力學(xué)過程。將70μL含不同濃度OTA的玉米樣品提取液分別與QBs熒光探針孵育3min,加入試紙條加樣孔,25min內(nèi)每隔30 s測定試紙條T線和C線熒光強度,結(jié)果見圖2A。從圖2A插圖可見,試紙條加入陰性玉米樣品提取液后,FIT和FIC值隨著反應(yīng)時間的延長而不斷增強,在25min內(nèi),T線和C線熒光強度未能進(jìn)入穩(wěn)定期；而試紙條FIT/FIC比值10min后基本穩(wěn)定（圖2A）,且在檢測低、高OTA濃度樣品時,試紙條的FIT/FIC比值在10min后均基本穩(wěn)定。基于上述結(jié)果,確定QBs熒光試紙條加樣后10min進(jìn)行定量檢測。

表1 棋盤滴定優(yōu)化QBs熒光探針用量以及T線抗原噴涂濃度（n=3）Table 1 Optimization of the volume of QB-probes and the concentration of OTA-BSA by using a checkerboard titration（n=3）

進(jìn)一步優(yōu)化了檢測體系的pH值、有機(jī)溶劑含量以及離子強度對試紙條T線和C線熒光強度以及檢測靈敏度的影響。從圖2B可知,溶液pH值對試紙條T線和C線熒光強度影響較小,但對試紙條競爭抑制效果影響較大；當(dāng)pH=7.0時,試紙條競爭抑制效率最好（0.5 ng/mLOTA）,達(dá)到42％（0.42±0.05）。因此本研究選用0.01 mol/L PB緩沖液（pH 7.0）為樣品的稀釋液。

圖2 QBs熒光試紙條檢測條件的優(yōu)化。（A）FIT/FIC值隨免疫反應(yīng)時間變化的動力學(xué)曲線,插圖為FIT,FIC值隨免疫免疫反應(yīng)時間變化的動力學(xué)曲線；（B）溶液pH值；（C）甲醇含量；（D）NaCl濃度對QBs熒光試紙條FIT和FIC、FIT/FIC值以及競爭抑制率的影響。OTA陽性加標(biāo)濃度為0.5 ng/mLFig.2 Optimization of detection conditions of QBs-based immunochromatographic strip.（A）Change of FIT/FICvalue along with immunoreaction time.The inset is the immunoreaction dynamics of FITand FICvalueswith immunoreaction time；Effect of pH value（B）,methanol content（C）and NaCl concentration（D）on FIT, FIC,FIT/FICvalue and inhibition rate.OTA concentration spiked in sample solution is 0.5 ng/mL

從圖2C可知,待測液中甲醇含量低于20％時,對試紙條T線和C線陰性顯色影響不顯著,但當(dāng)甲醇濃度為20％時,熒光試紙條對陽性加標(biāo)（0.5 ng/mL OTA）的競爭抑制率明顯下降,僅為13％（0.13± 0.02）,而甲醇濃度為10％時,試紙條競爭抑制率最高,約為44％（0.44±0.03）。因此檢測溶液中甲醇最適濃度設(shè)定為10％。

Huang等[17]在建立恩若沙星熒光試紙條定量檢測方法時發(fā)現(xiàn),高鹽離子濃度有利于抗體對恩若沙星分子的識別,從而提高了免疫層析定量檢測的靈敏度。本研究在含10％甲醇的0.01 mol/L PB緩沖液（pH 7.0）中添加不同終濃度NaCl,評價離子強度對試紙條檢測靈敏度的影響。從圖2D可見,隨著NaCl濃度增高,試紙條對OTA競爭抑制率（0.5 ng/mL）逐漸增高,但當(dāng)NaCl濃度為0.4 mol/L時,競爭抑制率反而下降,隨后當(dāng)NaCl濃度介于0.6～1.0 mol/L時,試紙條競爭抑制率陡然上升,且較未添加NaCl的對照組競爭抑制率提高了70％以上。推測高鹽濃度下（≥0.6 mol/L）試紙條競爭抑制率顯著提高的原因可能與以下因素有關(guān)：抗OTA單克隆抗體是以O(shè)TA羧基與BSA氨基偶聯(lián)產(chǎn)物免疫小鼠獲得,因此抗OTA單克隆抗體可能更易識別OTA分子中疏水區(qū)域；待測OTA分子中含有一個游離的羧基,在低鹽濃度下易于解離,而在高鹽濃度（≥0.6 mol/L）下,OTA分子更多以非解離態(tài)形式存在,因此有利于抗OTA單克隆抗體的識別,從而提高了試紙條的檢測靈敏度。從圖2D還可知,NaCl濃度介于0.6～1.0 mol/L時,試紙條檢測靈敏度差異不顯著。為了提高檢測穩(wěn)定性,本研究選擇檢測溶液中NaCl最佳濃度為0.8 mol/L。

3.3 QBs熒光試紙條用于OTA定量檢測

為了減少玉米樣品基質(zhì)的影響,本實驗采用OTA陰性的玉米樣品提取液配制OTA系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,繪制QBs熒光試紙條定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖3可知,QBs熒光試紙條定量檢測OTA線性范圍為0.05～1.0 ng/mL,線性回歸方程為Y=0.259lg X+ 0.897（R2=0.995）,檢測OTA的50％競爭抑制率濃度（IC50）為0.215 ng/mL。按標(biāo)準(zhǔn)曲線競爭抑制率為10％時定義試紙條最低檢測靈敏度[18]圖, 則3圖QB3s熒光試紙條檢測標(biāo)準(zhǔn)溶液中 OTA最低靈敏度為0.05 ng/mL,比已有的膠體金試紙條方法的靈敏度提高一個數(shù)量級[19]。

3.4 QBs熒光試紙條對OTA檢測性能的評價

以糧食中常污染的5種真菌毒素（黃曲霉毒素B1、伏馬菌素B1、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及桔霉素）評價QBs熒光試紙條的特異性,結(jié)果表明,5種真菌毒素即使在高濃度下（100 ng/mL）,試紙條T/C比值均未見明顯下降,表明QBs熒光試紙條具有較好的特異性。

QBs熒光試紙條的準(zhǔn)確性以及精密度通過加標(biāo)回收實驗進(jìn)行評價。從表2可知,3個加標(biāo)水平的平均回收率為107.2％～125.5％,RSD均小于10％,表明QBs熒光試紙條的準(zhǔn)確性及精密度滿足快速定量篩查方法的需求。為了進(jìn)一步評價試紙條的實用性,分別采用QBs熒光試紙條及OTA酶聯(lián)免疫試劑盒檢測了40個OTA加標(biāo)的實際玉米樣品,結(jié)果見圖4。QBs熒光試紙條檢測結(jié)果與酶聯(lián)免疫試劑盒檢測結(jié)果的相關(guān)性方程為Y=0.970X+0.184（R2=0.975）,表明兩種方法具有較好的一致性。與酶聯(lián)免疫試劑盒方法相比,QBs熒光試紙條法操作更為簡單,檢測時間僅需10 min；與常規(guī)膠體金試紙條法相比,QBs熒光試紙條具有更高的檢測靈敏度,且可實現(xiàn)定量分析[19]。

表2 玉米中OTA加標(biāo)回收實驗Table 2 Recovery of QBs-based strip test in OTA spiked maize samples

圖4 QBs熒光試紙條及酶聯(lián)免疫試劑盒檢測40個玉米加標(biāo)樣品的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation between results of QBs-based immunochromatographic strip（X axis）and enzyme-linked immunosorbentassay（ELISA）kit（Y axis）analyses ofOTA in 40 spiked maize samples

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（Received 5 June 2015；accepted 25 August2015）

This work was supported by the National Basic Research Program of China（No.2013CB127804）,the National Natural Science Foundation of China（No.3127186）and the Training Plan for the Main Subject of Academic Leaders of Jiangxi Province（No.20142BCB22004 ）

Immunochromatographic Assay for Quantitative Detection of Ochratoxin A in M aize by Quantum Dot Beads

ZHOU Yao-Feng1,XIONG Si-Cheng1,JIANG Hu1,2,DUAN Hong1,2,XIONG Yong-Hua*1,2,WANG Andrew31（State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China）
2（Jiangxi-OAIJoint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China）
3（Ocean NanoTech,LLC.,San Diego,CA92126,USA）

Fluorescence probes were prepared by coupling the ascetic fluid containing anti-ochratoxin A （OTA） monoclonal antibody with quantum dot beads（QBs） using 1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride method.The OTA-labeled bovine serum albumin（BSA）conjugates and donkey anti-mouse polyclonal antibodieswere sprayed onto the nitrocellulosemembrane as the test and control lines,respectively.The resultant fluorescence probes were introduced into the immunochromatographic strip （ICA）for sensitive,rapid and quantitative detection of OTA in maize based on the ratio of fluorescence intensities of testand control lines.The QBs-based ICA exhibited dynamic linear range for detection of OTA in maize extract from 0.05 ng/mL to 1.0 ng/mL（Y=0.259ln X+0.897,R2=0.995）,with the median inhibitory concentration of（0.215±0.023）ng/mL（n=5）.The detection limit for OTA was 0.05 ng/mL in maize extract,and the detection time of the proposed QBs-based ICA for each sample was 10 min.The recoveries of OTA at three spiked levels were 107.2％-125.5％,while relative standard deviations were below 10％.Forty naturalmaize sampleswere assayed using both QB-ICA and enzyme-linked immunosorbent assay,and the results from the twomethods showed a highly significant correlation（R2=0.975）.

Quantum dots beads；Immunochromatographic assay；Ochratoxin A；Quantitative detection

10.11895/j.issn.0253-3820.150468

2015-06-05收稿；2015-08-25接受

本文系國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃,No.2013CB127804）,國家自然科學(xué)基金（No.31271863）及江西省主要學(xué)科與技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計劃（No.2014BCB22004）資助

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