生物?；甫?acylaseΙ)對溴代苯丙氨酸手性拆分的研究

于 芳，郭棟才，于海洋，劉莎莎，何宇鵬

（遼寧石油化工大學 化學與材料科學學院， 遼寧 撫順 113001）

科研與開發

生物?；甫?acylaseΙ)對溴代苯丙氨酸手性拆分的研究

于 芳，郭棟才，于海洋，劉莎莎，何宇鵬

（遼寧石油化工大學 化學與材料科學學院， 遼寧 撫順 113001）

利用生物?；?Ι (acylase Ι)可以選擇性的切除S-型苯丙氨酸上酰胺鍵的特點，高效快捷的對外消旋溴代苯丙氨酸進行手性拆分，成功的分離得到了互為異構體的溴代苯丙氨酸鹽酸鹽，并使用了核磁共振、高分辨質譜和旋光值對結果進行了表征，為含有苯丙氨酸衍生物結構的天然產物分子和藥物分子的合成提供了一個高效便捷的路線。

?；?Ι；溴代苯丙氨酸；手性拆分

目前，非天然氨基酸的合成及手性拆分已經成為了有機化學合成界的熱點[1]，目前比較普遍的方法主要是有通過有機小分子催化劑[2,3]和手性配體[4]的調控來實現非天然氨基酸的不對稱合成和手性拆分。在上述方法中，特定的小分子催化劑和手性配體對于氨基酸特定的手性構型有著較強的專一性，比較適合用于合成單一構型的非天然氨基酸化合物。但是如果在合成過程中，需要同時得到兩種互為對映異構體的非天然氨基酸分子，小分子催化劑和手性配體的的實用性則略顯不足。2002年，德國的Waldmann教授總結歸納了大量的利用天然生物酶對外消旋氨基酸進行手性拆分的實例[5]。其中提到了?；甫?acylase Ι)[6-8]可以用于苯丙氨酸的手性拆分，即可以同時得到兩種互為對映異構體的手性氨基酸。苯丙氨酸是生命體不可缺少的氨基酸，苯丙氨酸的衍生物也是在諸多天然產物分子和藥物分子中經常出現的重要結構片段，而溴代苯丙氨酸因為其芳溴結構可以做出進一步更為多樣的衍生化而顯得更為重要[9-11]。本文則是利用了acylase Ι作為催化劑對溴代苯丙氨酸進行手性拆分的學術研究。

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

二苯亞甲基氨基乙腈，3-溴芐溴，芐基三乙基氯化銨，二氯化鈷，乙酸酐，acylase Ι等分析純試劑，美國Aldrich公司。核磁共振儀：Varian Mercury 400。(FAB)-質譜儀：Typs Jeol SX 102 A。旋光儀：Schmidt + Haensch HH8，Na-D-Linie。

1.2 外消旋3-溴苯丙氨酸(5)的合成

實驗使用了二苯亞甲基氨基乙腈(1)和3-溴芐溴(2)作為初始反應物，以甲苯作為溶劑，并在相轉移催化劑-芐基三乙基氯化銨(TEBA)(3)和30%的NaOH水溶液的作用下制備了氨基酸前體分子4，之后再用鹽酸將二苯基脫去得到外消旋的3-溴苯丙氨酸(5)。反應路線如圖1所示。

圖1 外消旋的3-溴苯丙氨酸(5)的合成Fig.1 Synthesis of racemic 3-bromophenylalanine (5)

操作步驟：

將80 g (0.36 mol) 二苯亞甲基氨基乙腈(1)和6.9 g (0.03 mol) 芐基三乙基氯化銨(3) 溶于150 mL的甲苯溶劑中，再向溶劑中加入250 mL的30% NaOH水溶液。將反應體系冷卻至0 ℃，并向溶劑中滴加3-溴芐溴(2)的甲苯溶液(100 g 3-溴芐溴溶于100 mL甲苯溶液)。反應在室溫下攪拌16 h后，向反應液中加入200 mL水，并用300 mL的二氯甲烷萃取3次。再將合并的有機相用飽和食鹽水洗滌一次，并用無水硫酸鎂進行干燥，過濾。蒸干溶劑后可得到無色的固體產物4，產率92%。

將140 g (0.36 mol) 分子4溶于300 mL甲苯溶液中，并加入800 mL 6 mol/L的鹽酸水溶液。將反應液加熱回流16 h后冷卻至室溫，將反應體系中的不溶物過濾，可得到無色固體產物5，產率100%。

1.3 (S)/(R)-3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽(7, 9)的合成

實驗首先使用了乙酸酐對外消旋3-溴苯丙氨酸進行酰基化，得到氨基酸衍生物6，而后在氯化鈷的作用下利用acylase Ι 將S-型氨基酸的酰胺鍵脫去[8]，得到(S)-3-溴苯丙氨酸(7)，而R-型氨基酸8的酰胺鍵則被保留[8]。此時兩種不同構型的氨基酸由于取代基團已經不同，其分子結構展示出較大的極性差異，可以通過萃取的方式進行分離。脫去了酰胺鍵的S-型氨基酸由于極性非常大，所以可以在水中完全溶解；而保留了酰胺鍵的R-型氨基酸則可以溶于有機溶劑。之后再將未脫去酰胺鍵的R-型氨基酸用HCl將酰胺鍵脫去，即可得到(R)-3-溴苯丙氨酸(9)。反應路線如圖2所示。

圖2 (S)/(R)-3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽(7, 9)的合成Fig.2 Synthesis of (S)/(R)-3-bromobenzenealanine hydrochloride (7, 9)

操作步驟：

將100 g (0.35 mol) 外消旋氨基酸5 溶于1 L水中，并用2 mol/L的氫氧化鈉溶液將溶劑的pH值調至12[12]。之后將水蒸干，并將剩余的部分轉移到900 mL醋酸中。之后向此醋酸溶液中緩慢滴加39 mL (0.42 mol)乙酸酐，并在室溫下攪拌16 h。反應結束后將醋酸溶劑蒸干，并將剩余部分轉移到1 L的水中，再用飽和的鹽酸水溶液將反應體系的pH值調制1。用100 mL的乙酸乙酯萃取三次，將合并的有機相用飽和食鹽水洗滌一次，并用無水硫酸鎂進行干燥，過濾。蒸干溶劑后可得到無色的固體產物6，產率78%。

將75 g (0.26 mol) 乙酰氨基酸6加入到1.5 L的水中，并用4 mol/L的氫氧化鈉水溶液將反應液的pH值調制7.5～8.0之間。在氬氣的保護下向反應液中加入0.74 g (5.72 mol) 的二氯化鈷和3.17 g acylase Ι，并在室溫下攪拌24 h(盡可能做到每4個小時測一次pH值)。向反應液中加入1 g的活性炭，并在60 ℃攪拌30 min。冷卻至室溫后，用飽和鹽酸水溶液將反應液的pH值調制1，然后用500 mL的乙酸乙酯萃取三次。將水相的溶劑蒸干，可得到無色固體(S)-3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽(7)，產率46%。將合并的有機相用飽和食鹽水洗滌一次，并用無水硫酸鎂進行干燥，過濾，蒸干溶劑后可得到無色的固體產物8，產率48%。

將R-型乙酰氨基酸8加入到1 L的3 mol/L的鹽酸溶液中，并加熱回流16個小時。之后將反應冷卻至室溫，蒸干溶劑，得到無色的固體(R)-3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽(9)，產率100%。

2 結果與討論

2.1 (S)-3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽(7)的數據表征

核磁共振數據：1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 3.20 (dd,3J = 7.4 Hz, 7.2 Hz, 1H), 3.44 (dd,3J = 5.7 Hz, 7.3 Hz, 1H), 4.30 (dd,3J = 7.4Hz, 7.2 Hz, 1H), 7.32 (m, 2H), 7.51 (m, 1H), 7.54 (m, 1H).13C-NMR (100 MHz, CD3OD): δ = 37.6, 55.7, 124.7, 130.3, 132.7, 132.8, 134.4, 139.1, 174.9. 由上述數據可知，在氫譜中，化學位移值在3.20和3.44處為芐基上的兩個氫，4.30處為手性中心的氫，從7.32至7.54之間的4個氫為苯環上的氫；碳譜中，37.6為芐基碳，55.7為手性碳原子，從124.7至139.1處為六個苯環碳，174.9為羰基碳。

另外，高分辨質譜測得了該化合物去掉了一個氯離子的分子量，理論值[M-Cl-]+為243.9958，實際測量值為243.9964，誤差為百萬分之二。旋光值(c = 1.0, MeOH)。

2.2 (R)-3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽(9)的數據表征

核磁共振數據：1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 3.20 (dd,3J = 7.4 Hz, 7.0 Hz, 1H), 3.44 (dd,3J = 5.7 Hz, 7.3 Hz, 1H), 4.31 (dd,3J = 7.4Hz, 7.2 Hz, 1H), 7.33 (m, 2H), 7.51 (m, 1H), 7.54 (m, 1H).13C-NMR (100 MHz, CD3OD): δ = 37.6, 55.7, 124.7, 130.3, 132.7, 132.8, 134.4, 139.1, 174.8. 由上述數據可知，在氫譜中，化學位移值在3.20和3.44處為芐基上的兩個氫，4.31處為手性中心的氫，從7.33至7.54之間的4個氫為苯環上的氫；碳譜中，37.6為芐基碳，55.7為手性碳原子，從124.7至139.1處為六個苯環碳，174.8為羰基碳。

另外，高分辨質譜測得了該化合物去掉了一個氯離子的分子量，理論值[M-Cl-]+為243.9968，實際測量值為243.9950，誤差為百萬分之四。旋光值(c = 1.0, MeOH)。

2.3 (S/R)-3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽(7/9)的數據對比

由此互為對映異構體的3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽的數據對比可見，兩個化合物的核磁譜圖完全重合，且氫譜裂分幾乎完全一致。但兩個化合物旋光值的絕對值相近，而且正負相反，可以得出結論，本實驗所得到的確實為互為對映異構體的兩個3-溴苯丙氨酸鹽酸鹽。

3 結 論

（1）本實驗成功的使用了?；?acylase Ι)對乙酰化的外消旋3-溴苯丙氨酸進行了選擇性的去酰胺化，并以較高的產率得到了互為對映異構體的溴苯丙氨酸鹽酸鹽分子。

（2）通過核磁共振、高分辨質譜以及旋光值等數據進一步證明了該實驗結果的準確性。

（3）本實驗結果說明了?；?acylase Ι)可以成功的拆分含有溴取代的苯丙氨酸衍生物，對含有苯丙氨酸衍生物結構的天然產物分子和藥物分子的合成提供了一個高效便捷的路線。

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Study on Chiral Resolution of Bromophenylalanine by Biological Acylase Ι

YU Fang, GUO Dong-cai, YU Hai-yang, LIU Sha-sha, HE Yu-peng
（School of Chemistry and Material Science, Liaoning Shihua University, Liaoning Fushun 113001, China）

Racemic bromophenylalanine was separated into enantiomeric isomers by biological caylase Ι which can remove the amide bond of S-type phenlyalamine selectivity and efficiency. The isolated products were characterized by NMR, HR-MS, and Polarimeter. Finally the results provided an efficient and convenient route to synthesize nature products and drug molecules with optically pure phenylalanine derivative structure.

Acylase Ι; Bromophenylalanine; Chiral separation

TQ 028

： A

： 1671-0460（2015）02-0221-03

國家自然科學基金項目, 項目號：21202077。

2014-12-08

于芳（1984-），女，湖北恩施人，講師，博士，2011年畢業于沈陽藥科大學藥物化學專業，研究方向：從事天然產物化學和不對稱催化方面的研究。E-mail：yufang1112002@163.com。

何宇鵬（1979-），男，副教授，博士，2010年畢業于德國Max-Planck-Institute for Molecular Physiology in Dortmund, 研究方向：從事天然產物化學和不對稱催化方面的研究。E-mail：yupenghe2014@163.com。