響應(yīng)面法優(yōu)化黃酒釀造工藝

崔 闖，任 清*

響應(yīng)面法優(yōu)化黃酒釀造工藝

崔 闖，任 清*

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048）

以小米為原料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對小米黃酒的釀造工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：回歸方程擬合性好，在酒曲添加量0.9%、糖化時間63 h、糖化溫度31 ℃、酵母添加量0.39%、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時間5 d時為最佳釀造條件。在此最優(yōu)條件下，驗證優(yōu)化工藝得到最大糖度、最小酸度及最大酒精體積分?jǐn)?shù)分別為17.25%、0.377 1和12.10%，與模型預(yù)測值17.26%、0.377 3和12.00%無顯著性差異，表明通過響應(yīng)面法優(yōu)化的回歸方程具有一定的實踐指導(dǎo)意義。

小米；黃酒；響應(yīng)面法；釀造工藝

谷子為五谷之一，屬禾本科，狗尾草屬，起源于我國，是世界上古老的農(nóng)產(chǎn)品之一[1]，谷子脫殼后為小米，其具有生育期短、適應(yīng)性廣、價格低廉等優(yōu)點[2-4]。小米的營養(yǎng)豐富[5]，含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸、維生素及礦物質(zhì)等[6]，且各種營養(yǎng)物質(zhì)比例適宜，是一種良好的營養(yǎng)源[7]，但多年以來人們對小米的食用方法比較單一，對小米的深加工研究也一直沒有引起足夠的重視[8-17]，因此，為小米資源的深加工開辟新途徑具有重要意義。黃酒是我國特有的傳統(tǒng)酒種，是世界上最古老的三大釀造酒之一[18]，隨著人們物質(zhì)文化生活水平的日益提高，消費者對黃酒這一產(chǎn)品的要求也不斷提高，黃酒的營養(yǎng)價值和口感越來越受到消費者的普遍重視[19]。

本實驗以小米作為釀造原料，采用Box-Behnken響應(yīng)面法得到其制備黃酒的最優(yōu)釀造條件，旨在為實現(xiàn)小米資源的開發(fā)利用及黃酒新產(chǎn)品的開發(fā)提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

小米：“張雜谷7號”由張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

酒曲、酵母 湖北安琪生物集團(tuán)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

THZ-D臺式恒溫振蕩器 蘇州市培英實驗設(shè)備有限公司；T-6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Allegra 64r臺式高速冷凍離心機 美國Beckman公司；酒精計 河間市雙塔儀表廠。

1.3實驗方法

1.3.1小米黃酒釀造工藝流程

1.3.2理化指標(biāo)測定

還原糖含量的測定：3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色定糖法[20]；酸度的測定[21]：分別從發(fā)酵醪的上層、中層、下層3點取樣并混合均勻，再取混合之后的樣品10 g，放于研缽中研磨成勻漿，之后加入100 mL無CO2的水，攪拌均勻后靜置30 min，期間攪拌一次，取上清液用已標(biāo)定的0.1 mol/L的NaOH溶液進(jìn)行滴定。酒精體積分?jǐn)?shù)、總糖、總酸、非糖固形物、氨基酸態(tài)氮的測定：均參照GB/T 13662—2008《黃酒》[22]中相關(guān)指標(biāo)的方法測定。

1.3.3感官評定方法

從釀造的黃酒中取樣并進(jìn)行感官評價，主要指標(biāo)為外觀、香氣、口味和風(fēng)格四方面。

1.3.4統(tǒng)計分析方法

每個單因素試驗在相同的試驗條件下重復(fù)操作3次，對驗證實驗結(jié)果采用方差分析方法比較結(jié)果與預(yù)測值之間的顯著性差異。

1.4影響小米黃酒糖化工藝的單因素試驗

1.4.1加曲量對小米黃酒糖化效果的影響

向蒸熟淋冷后的小米中分別添加0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2%的酒曲，攪拌均勻后搭窩，于30 ℃條件下糖化48 h后，取樣測定其糖度和酸度。

1.4.2糖化時間對小米黃酒糖化效果的影響

向蒸熟淋冷后的小米中添加0.8%的酒曲，攪拌均勻后搭窩，于30 ℃條件下分別糖化24、36、48、60、72 h后，取樣測定其糖度和酸度。

1.4.3糖化溫度對小米黃酒糖化效果的影響

向蒸熟淋冷后的小米中添加0.8%的酒曲，攪拌均勻后搭窩，分別于20、25、30、35、40 ℃條件下糖化60 h后，取樣測定其糖度和酸度。

1.5響應(yīng)面法優(yōu)化小米黃酒糖化工藝

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇加曲量、糖化時間及糖化溫度為響應(yīng)面優(yōu)化的考察因素，并以-1、0、1分別代表因素的水平，以糖化結(jié)束的黃酒糖度及酸度為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗。

1.6影響小米黃酒發(fā)酵工藝的單因素試驗

1.6.1酵母添加量對小米黃酒發(fā)酵效果的影響

向一定量經(jīng)過糖化的小米中，分別添加0.18%、0.25%、0.32%、0.39%和0.46%的酵母，攪拌均勻后于35 ℃條件下發(fā)酵3 d，確定產(chǎn)酒量并測定酒液的酒精體積分?jǐn)?shù)、總糖及總酸含量。

1.6.2發(fā)酵溫度對小米黃酒發(fā)酵效果的影響

向一定量經(jīng)過糖化的小米中添加0.39%的酵母攪拌均勻后，分別于29、32、35、38、41 ℃條件下發(fā)酵3 d，確定產(chǎn)酒量并測定酒液的酒精體積分?jǐn)?shù)、總糖及總酸含量。

1.6.3發(fā)酵時間對小米黃酒發(fā)酵效果的影響

向一定量經(jīng)過糖化的小米中添加0.39%的酵母攪拌均勻后，于32 ℃條件下分別發(fā)酵2、3、4、5、6 d，確定產(chǎn)酒量并測定酒液的酒精體積分?jǐn)?shù)、總糖及總酸含量。

1.7響應(yīng)面法優(yōu)化小米黃酒發(fā)酵工藝

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇酵母添加量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間為響應(yīng)面優(yōu)化的考察因素，并以-1、0、1分別代表因素的水平，以發(fā)酵結(jié)束的黃酒酒精體積分?jǐn)?shù)為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1糖化工藝單因素試驗及結(jié)果

2.1.1加曲量對小米黃酒糖化效果的影響

圖1 酒曲添加量對糖化效果的影響Fig.1 Effect of koji concentration on saccharification efficiency

由圖1可知，隨著酒曲添加量的增加，糖度逐漸增加，當(dāng)酒曲添加量為0.6%～1.0%時，糖度變化不大，酸度則呈現(xiàn)先升高再降低，最后又升高的過程。黃酒屬于開放式發(fā)酵，發(fā)酵過程中來自環(huán)境中的微生物也會進(jìn)入發(fā)酵醪中參與發(fā)酵，如果糖化速率過快，產(chǎn)酸菌就會大量繁殖，導(dǎo)致酸度升高[23]。在糖度變化不大的條件下考察酸度，酸度高則會影響黃酒品質(zhì)，故加曲量存在最適用量，綜合考慮，加曲量取0.8%較合適。

2.1.2糖化時間對小米黃酒糖化效果的影響

由圖2可知，隨著糖化時間的延長，糖度不斷增加，在糖化時間為60 h時，糖度達(dá)到最大值，酸度隨著糖化時間的延長呈現(xiàn)上升的趨勢。糖化時間短，小米含有的淀粉未得到充分水解，隨著糖化時間的延長，小米中的淀粉被不斷水解轉(zhuǎn)化為糖，糖度不斷增加，當(dāng)糖化時間超過60 h時，糖度呈下降趨勢，酸度呈上升趨勢，說明糖化已進(jìn)行的比較徹底，產(chǎn)酸菌的比重增加。綜合考慮，糖化時間為60 h較合適。

圖2 糖化時間對糖化效果的影響Fig.2 Effect of saccharification time on saccharification efficiency

2.1.3糖化溫度對小米黃酒糖化效果的影響

圖3 糖化溫度對糖化效果的影響Fig.3 Effect of saccharification temperature on saccharification efficiency

由圖3可知，一開始糖度隨著溫度的升高而增加，當(dāng)溫度為30 ℃時達(dá)到最大值，之后則隨著溫度的升高呈下降趨勢，酸度則隨著溫度的升高呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。分析原因可知，溫度低時糖化速率慢，雜菌生長競爭力強，導(dǎo)致樣品酸度很高；隨著溫度的升高，酒曲對淀粉水解程度增加，糖度升高，酸度降低；當(dāng)溫度超過酒曲的最適溫度時，酒曲的活性降低，從而使糖化效果變差，嗜熱產(chǎn)酸菌活力更強，導(dǎo)致樣品酸度上升，最終確定最適糖化溫度為30 ℃，這與現(xiàn)有相關(guān)研究結(jié)論一致[24]。

2.2響應(yīng)面優(yōu)化糖化工藝試驗結(jié)果及分析

響應(yīng)面法優(yōu)化小米黃酒糖化工藝的試驗結(jié)果見表1。通過Design Expert 8.0.6.1軟件對試驗進(jìn)行回歸分析，預(yù)測小米黃酒糖化的最優(yōu)工藝參數(shù)，方差分析結(jié)果見表2、3。

對表1中的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合后，分別得到各因素水平對黃酒糖化糖度（Y1）與黃酒糖化酸度（Y2）影響的二次多項回歸模型：

分別對兩種模型采用二次型進(jìn)行變異分析，方程的相關(guān)系數(shù)分別為R12=0.992 5，R22=0.920 1，說明兩種模型擬合程度均較好，可以用于小米黃酒糖化工藝實驗的預(yù)測。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 1 Box-Behnken design with experimental values of sugar content and aciddiittyy

表2 以糖度為響應(yīng)值回歸模型的方差分析Table 2 Analysis of variance of sugar content

由表2、3可知，方程（1）中除AB與A2項無顯著影響外，其他項對糖度的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；方程（2）中C項和C2項對酸度的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。另外，在選定的實驗范圍內(nèi)，各因素對試驗結(jié)果的重要性與F值的大小呈正比，各因素對糖度及酸度的影響大小順序均為糖化溫度＞糖化時間＞加曲量。

表3 以酸度為響應(yīng)值回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of acidity

2.3小米黃酒糖化工藝條件驗證

采用Design Expert 8.0.6.1統(tǒng)計軟件聯(lián)合求解模型方程（1）和（2），得出小米黃酒糖化的最優(yōu)工藝參數(shù)：酒曲添加量0.9%、糖化時間63.1 h、糖化溫度31.67 ℃。為了檢驗響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行小米黃酒的糖化。考慮到實際操作的便利，將小米黃酒糖化工藝參數(shù)優(yōu)化為酒曲添加量0.9%、糖化時間63 h、糖化溫度31 ℃，根據(jù)此最優(yōu)參數(shù)進(jìn)行小米黃酒的糖化（n=3）。結(jié)果表明，平均糖度為17.25%，預(yù)測值為17.26%，經(jīng)顯著性方差分析，P=0.373 9＞0.05，可以認(rèn)為實驗結(jié)果與預(yù)測值之間無顯著性差異，平均酸度為0.377 1，預(yù)測值為0.377 3，經(jīng)顯著性方差分析，P=0.101 2＞0.05，可以認(rèn)為實驗結(jié)果與預(yù)測值之間無顯著性差異，表明該模型可以較好地反映出小米黃酒糖化工藝條件，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化小米黃酒糖化工藝結(jié)果可靠。

2.4發(fā)酵工藝單因素試驗及結(jié)果

2.4.1酵母添加量對小米黃酒發(fā)酵效果的影響

圖4 酵母添加量對發(fā)酵效果的影響Fig.4 Effect of yeast concentration on fermentation efficiency

如圖4所示，隨著酵母添加量的增大，產(chǎn)酒量呈現(xiàn)先升高后緩慢降低的趨勢，酒精體積分?jǐn)?shù)逐漸升高，并在添加量0.39%時達(dá)到最大，而后逐漸下降，其原因可能是較高添加量的酵母菌完成自身繁殖需要消耗大量的糖類物質(zhì)，致使發(fā)酵液中轉(zhuǎn)化為酒精的糖度降低，從而使酒精體積分?jǐn)?shù)偏低，因此酵母添加量為0.39%較合適，表4顯示各組酒液的總酸及總糖值均符合黃酒標(biāo)準(zhǔn)。

表4 酵母添加量對小米黃酒指標(biāo)的影響Table 4 Effect of yeast concentration on sensory and chemical indicators of millet yellow wine

2.4.2發(fā)酵溫度對小米黃酒發(fā)酵效果的影響

圖5 發(fā)酵溫度對發(fā)酵效果的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on fermentation efficiency

由圖5可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為29～35 ℃時酒樣的酒精體積分?jǐn)?shù)差別不大，當(dāng)發(fā)酵溫度超過35 ℃時酒精體積分?jǐn)?shù)降低。這是因為酵母的活性存在最適溫度，溫度過高或過低都會抑制酵母的活性[25]，進(jìn)而影響發(fā)酵效果，結(jié)合出酒量考慮發(fā)酵溫度為32 ℃較合適，表5顯示各組酒液的總酸及總糖均符合黃酒標(biāo)準(zhǔn)。

表5 發(fā)酵溫度對小米黃酒指標(biāo)的影響Table 5 Effect of fermentation temperature on sensory and chemical indicators of millet yellow wine

2.4.3發(fā)酵時間對小米黃酒發(fā)酵效果的影響

圖6 發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響Fig.6 Effect of fermentation time on fermentation efficiency

由圖6可知，一開始隨著發(fā)酵時間的延長，酒精體積分?jǐn)?shù)迅速增加，當(dāng)發(fā)酵時間超過4 d之后酒精體積分?jǐn)?shù)的增加趨于平緩，可能是因為糖化液中大部分的還原糖已被酵母轉(zhuǎn)化為酒精[26]，產(chǎn)酒量則在發(fā)酵第5天時達(dá)到最大，從生產(chǎn)上考慮，選擇發(fā)酵5 d最為合適，表6顯示各組酒液的總酸及總糖均符合黃酒標(biāo)準(zhǔn)。

表6 發(fā)酵時間對小米黃酒發(fā)酵指標(biāo)的影響Table 6 Effect of fermentation time on sensory and chemical indicators of millet yellow wine

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝試驗結(jié)果及分析

表7 小米黃酒發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Response surface design with experimental values of alcohol content

對表7中試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合后，得到各因素水平對黃酒酒精體積分?jǐn)?shù)（Y）影響的二次多項回歸模型：

對該模型采用二次型進(jìn)行變異分析，方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.901 2，說明該模型擬合程度較好，可以用于小米黃酒發(fā)酵工藝實驗的預(yù)測。

響應(yīng)面法優(yōu)化小米黃酒發(fā)酵工藝的試驗結(jié)果見表7。通過Design Expert 8.0.6.1軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析，預(yù)測小米黃酒發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)，方差分析結(jié)果見表8。

表8 以酒精體積分?jǐn)?shù)為響應(yīng)面結(jié)果的方差分析Table 8 Analysis of variance of alcohol content

由表8可知，方程（3）中A2項對酒精體積分?jǐn)?shù)的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），B2項和C2項對酒精體積分?jǐn)?shù)的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。另外，在選定的實驗范圍內(nèi)，各因素對試驗結(jié)果的重要性與F值的大小呈正比，從表8中可以推斷出各因素對酒精體積分?jǐn)?shù)的影響大小順序是：發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度＞酵母添加量。

2.6小米黃酒發(fā)酵工藝條件驗證

通過Design Expert 8.0.6.1統(tǒng)計軟件求解模型方程（3），得出小米黃酒發(fā)酵的最優(yōu)工藝條件：酵母添加量0.39%、發(fā)酵時間4.85 d、發(fā)酵溫度32.36 ℃。為了檢驗響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行小米黃酒的發(fā)酵，考慮到實際操作的便利，將小米黃酒發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化為酵母添加量0.39%、發(fā)酵時間5 d、發(fā)酵溫度32 ℃，根據(jù)此最優(yōu)參數(shù)進(jìn)行小米黃酒糖化（n=3）。結(jié)果顯示，平均酒精體積分?jǐn)?shù)為12.10%，預(yù)測值為12.00%，經(jīng)顯著性方差分析，P=0.287 9＞0.05，可以認(rèn)為實驗結(jié)果與預(yù)測值之間無顯著性差異，說明該模型可以較好地反映出小米黃酒發(fā)酵工藝條件，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化小米黃酒發(fā)酵工藝的結(jié)果可靠。

3 結(jié) 論

本實驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法對小米黃酒釀造工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并對試驗結(jié)果進(jìn)行了數(shù)學(xué)模擬和預(yù)測。最終確定了小米黃酒釀造的最優(yōu)參數(shù)：酒曲添加量0.9%、糖化時間63 h、糖化溫度31 ℃、酵母添加量0.39%、發(fā)酵時間5 d、發(fā)酵溫度32 ℃。各因素對響應(yīng)值均有極顯著影響，采用該條件進(jìn)行驗證實驗，得到的平均糖度、酸度和酒精體積分?jǐn)?shù)分別為17.25%、0.377 1和12.10%，經(jīng)方差分析，與預(yù)測值均無顯著性差異，綜合回歸模型分析及驗證實驗，采用響應(yīng)面法對小米黃酒釀造工藝進(jìn)行優(yōu)化方法可行，得出的最優(yōu)釀造工藝具有一定的實際應(yīng)用價值，以小米為原料釀造黃酒開發(fā)前景廣闊。

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Process Optimization for the Production of Chinese Yellow Wine by Response Surface Methodology

CUI Chuang, REN Qing*
(School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

In this study, millet was used to produce yellow wine by saccharification and subsequent fermentation. The production process was optimized using combination of single factor method and response surface methodology. A well-fitted regression model equation was established using Box-Behnken design. The results showed that the optimal conditions for producing Chinese yellow wine were found to be saccharification at 31℃for 63 h after addition of 0.9%koji followed by fermentation at 32℃for 5 d after inoculation of 0.39%yeast. Under these conditions, the maximum sugar content, the minimum acidity and the maximum alcohol content (by volume) of millet yellow wine were observed to be 17.25%, 0.377 1 and 12.10%, agreeing with the predicted values (17.26%, 0.377 3 and 12.00%). Key words: millet; yellow wine; response surface methodology; production process

TS262.4

1002-6630（2015）11-0134-06

10.7506/spkx1002-6630-201511026

2014-07-03

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303069-07）

崔闖（1990—），女，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：cc19901011@163.com

*通信作者：任清（1969—），男，副教授，博士，研究方向為生物活性成分的分離提取及功能。E-mail：renqing@th.btbu.edu.cn