一株產細菌素乳桿菌的鑒定及其 細菌素編碼基因的獲得

吳 軼，貢漢生*，劉文麗，李明月，王華東，王俊娟

一株產細菌素乳桿菌的鑒定及其 細菌素編碼基因的獲得

吳 軼，貢漢生*，劉文麗，李明月，王華東，王俊娟

（魯東大學食品工程學院，山東 煙臺 264025）

應用雙層平板打孔法，從自制櫻桃酒里分離的乳桿菌中篩選到一株對革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌均有明顯抑制作用的菌株，命名為LD 1.0008。通過API 50 CHL糖發酵產酸實驗、16S rDNA基因序列分析及其特異性recA基因多重聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），鑒定LD 1.0008為植物乳桿菌。排除有機酸的干擾，用多種蛋白酶處理后，其抑菌活性均有明顯降低，而用過氧化氫酶處理后其抑菌活性基本不變，從而確定LD 1.0008所產生的抑菌物質為細菌素。使用已報道的10 對植物乳桿菌細菌素基因片段設計的引物對菌株LD 1.0008進行PCR擴增，發現其至少含有4 個植物乳桿菌素相關編碼基因，即plnD、plnO、plnV和plnW。

細菌素；乳桿菌；鑒定；細菌素編碼基因

細菌素是細菌在代謝過程中合成并分泌到環境中的一類對同種或親緣關系較近的微生物有殺滅或抑制作用的蛋白質或多肽物質[1]。細菌素的抑菌作用具有廣譜性、穩定性和無毒性等特點，且加入食品后不影響食品的感官性狀。目前已成功應用于乳制品、肉制品、罐裝蔬菜、果汁、酒精飲料及葡萄酒的釀造等[2-5]。Nisin早在1998年已被50多個國家和地區允 許作為食品防腐劑，并在乳制品和罐頭制品中廣泛使用[6]。

植物源乳酸菌的研究正日益得到重視。來源于植物的植物乳桿菌可產生多種植物乳桿菌素，抑制其他微生物的生長，多數植物乳桿菌素屬于Ⅰ類或Ⅱ類細菌素，具有分子質量較小、熱穩定性高、可被蛋白酶降解的特點，主要抑制乳酸菌和其他革蘭氏陽性細菌，此外，據報道BacTN365等還能抑制革蘭陰性菌和霉菌的生長[7-8]。同時植物乳桿菌素的作用方式一般為殺菌和溶菌[9]，由于其自身的特性以及伴隨菌株在發酵過程中所產生的保健功效，使植物乳桿菌素具有廣泛的應用前景。產植物乳桿菌素的菌株主要從乳制品、植物原材料或發酵食品中

1.1 菌種、培養基與試劑

從自制櫻桃酒中分離出的34 株乳桿菌中篩選出1 株具有明顯抑菌活性的菌株，暫命名為LD 1.0008。指示菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 25922。

乳桿菌培養選用改良MRS培養基 英國Oxoid公司；指示菌培養選用營養肉湯培養基 北京奧博星公司。

過氧化氫酶、胃蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶美國Sigma公司；蛋白酶K 美國Amresco公司；木瓜蛋白酶 德國AB Enzymes公司；PCR Master Mix 立陶宛Thermo Scientifi c公司。

1.2 儀器與設備

SPX智能型生化培養箱 寧波江南儀器廠；高速冷凍離心機 上海安亭科技儀器廠；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 杭州博日科技有限公司；DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠；SC850型凝膠成像系統 上海山富科學儀器有限公司；細菌基因組提取試劑盒 天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 無細胞發酵上清液的制備

參考貢漢生等[11]的方法制備細菌素的無細胞發酵上清液，將菌株在30 ℃條件下靜置培養到穩定期（OD600nm≥1.9），12 000×g、4 ℃離心15 min收集上清液，用3 mol/L NaOH溶液調節pH值至6.5，排除有機酸的干擾。上清液用0.22 μm濾膜過濾后冷凍干燥濃縮，凍干后加入原體積1/10的滅菌超純水，溶解后放入-20 ℃冰箱中保存備用。

1.3.2 具有抑菌活性菌株的篩選

采用雙層平板打孔法[12]篩選具有抑菌活性的菌株，指示菌選用金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌。

1.3.3 菌株產抑菌物質的初步鑒定

取等量無細胞發酵上清液（pH 6.5），使用3 mol/L HCl溶液和3 mol/L NaOH溶液分別調pH值至以下各酶最適pH值，將終濃度1 mol/mL的過氧化氫酶、胃蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶分別加入無細胞發酵上清液中，37 ℃條件下培育2 h。將pH值調回到6.5，按1.3.2節方法進行抑菌實驗，用凍干濃縮相同倍數的改良MRS培養基與無細胞發酵上清液做相同處理后作為對照。篩選得到[7,10]，本實驗旨在從自制櫻桃酒中分離出具有高抑菌活性細菌素的乳桿菌，對產生細菌素的乳桿菌進行鑒定并獲得其所產細菌素的編碼基因，為植物乳桿菌素應用于食品防腐保鮮提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.3.4 糖發酵產酸實驗

挑取活化好的菌株4 500×g離心10 min，用2 mL無菌生理鹽水重懸菌體制成細胞懸液。根據API 50 CHL系統說明書操作。將結果輸入系統測定軟件API plus中，通過歸納菌株可發酵糖的種類初步確定其歸屬的種類。

1.3.5 16S rDNA基因和recA基因的PCR擴增及測序

依據試劑盒說明書方法提取菌株LD 1.0008基因組DNA。使用乳桿菌16S rDNA基因通用引物[13]和recA基因的特異性引物[14]擴增，引物序列如表1所示。16S rDNA基因和recA基因的PCR反應體系均為50 μL。16S rDNA擴增的循環參數為：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s、55 ℃復性45 s、72 ℃延伸90 s，35 個循環；72 ℃保溫10 min。recA基因擴增的循環參數為：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s、55 ℃復性45 s、72 ℃延伸40 s，35 個循環；72 ℃保溫10 min。反應完畢后分別取5 μL用于1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統下分析結果。PCR產物送交上海生工生物工程技術服務有限公司進行純化后測序。得到的PCR產物序列通過BLAST在GenBank中進行同源性比較，并將其鑒定到種。

表1 16S rDNA基因和rreeccAA基因的PCR擴增引物和條件Table 1 PCR primers used for 16S rDNA sequence analysis andrrecAbsd PCR

1.3.6 植物乳桿菌所產細菌素編碼基因的獲得

表2 植物乳桿菌素的PCR擴增引物和條件Table 2 PCR primers and thermal cycling conditions for the detection of plantariicciinn

如表2所示，根據已報道的植物乳桿菌素相關基因選擇10 對引物，PCR擴增菌株LD 1.0008中可能含有的植物乳桿菌素相關基因，并進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果及其菌落特征

從自制櫻桃酒中分離出的34 株乳桿菌，以金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌為指示菌進行抑菌實驗，以抑菌圈直徑＞10 mm記為具有抑菌活性，從34 株乳桿菌中篩選出一株對兩種指示菌均有明顯抑菌活性的菌株，命名為LD 1.0008。

菌株LD 1.0008的菌落特征：在改良MRS培養基上培養36 h后菌落直徑大小為1.5 mm左右，光滑、濕潤、圓形、突起、呈乳白色、不透明、邊緣整齊。

菌株LD 1.0008的菌體特征：短桿、呈單個均勻散落、革蘭氏陽性、著色均勻。

2.2抑菌物質初步鑒定結果

將無細胞發酵上清液調pH值至6.5，排除了有機酸的干擾，經各種酶處理后發酵上清液的抑菌效果如表3所示。經過氧化氫酶處理后，發酵上清液的抑菌效果與未經處理的對照組相差不大，可排除過氧化氫的干擾；而經胃蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶處理后，無細胞發酵上清液的抑 菌圈顯著減小，從而確定該菌株產生的抑菌物質為蛋白質類細菌素。

表3 酶處理后的抑菌效果Table 3 Antibacterial activity after enzymatic treatments

2.3糖發酵產酸實驗結果

按照API 50 CH試劑條使用說明，采用API 50 CHL培養基對菌株LD 1.0008進行49 種碳水化合物的發酵產酸實驗，結果見表4。將表4中的鑒定結果用API plus軟件進行鑒定，結果表明，菌株LD 1.0008與植物乳桿菌有66%的同源性，與戊糖乳桿菌有34%的同源性。

表4 LD 1.0008的API 50 CHL反應結果Table 4 Carbohydrate utilization of LD 1.0008 using API 50 CHL

2.4 16S rDNA基因與recA基因的鑒定結果

通過對菌株LD 1.0008的16S rDNA基因和recA基因進行PCR擴增，分別獲得了大小為1 479 bp和287 bp的基因片段，如圖1所示，將所得序列在BLAST軟件上與已知菌株的16S rDNA序列和recA序列進行同源性對比，結果表明菌株LD 1.0008的16S rDNA序列與GenBank中植物乳桿菌、戊糖乳桿菌和亞利桑那乳桿菌的16S rDNA序列同源性均達到99%以上。

圖1 16S rDNAA與rreeccAA基因PCR擴增產物電泳圖Fig.1 PCR amplification of 16S rDNA andrecAgenes

LD 1.0008的recA基因序列與植物乳桿菌的recA基因序列有99%的同源性，與亞利桑那乳桿菌的recA基因序列有94%的同源性，與戊糖乳桿菌的部分recA基因序列有88%的同源性，據此判定菌株LD 1.0008為植物乳桿菌。

2.5產植物乳桿菌素編碼基因的獲得

使用10 對已報道的乳桿菌素引物分別對菌株LD 1.0008基因組DNA進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后發現，應用plnD、plnO、plnV和plnW的引物擴增出現了基因條帶，PCR產物純化后測序，分 別得到382、189、710、728 bp的基因片段，在GenBank中進行基因序列比對，4 條基因序列與plnD、plnO、plnV和plnW部分基因序列的同源性都達到99%以上，據此可推斷植物乳桿菌LD 1.0008可產生多種植物乳桿菌素。

圖2 乳桿菌素編碼基因PCR擴增產物電泳圖Fig.2 PCR amplification of plantaricin genes

3 結 論

本實驗篩選得到一株對革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌均有抑制作用的乳桿菌LD 1.0008。通過API 50 CHL生化鑒定、16S rDNA基因序列分析及其特異性recA基因多重PCR反應，最終鑒定該菌為植物乳桿菌。使用已報道的10 對根據植物乳桿菌素基因片段設計的引物，對菌株LD 1.0008進行PCR擴增，發現其至少含有4 個植物乳桿菌素相關編碼基因：plnD、plnO、plnV和plnW。與目前國內外已發現的高產細菌素的植物乳桿菌相比，LD 1.0008產生的細菌素種類多，可同時抑制革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌，且可被多種蛋白酶水解，不會對人體造成傷害，這對于分離LD 1.0008產生的植物乳桿菌素并將其應用于食品防腐保鮮具有重要意義。

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Identification of a Bacteriocin-Producing Lactobacillus and Acquisition of Bacteriocin-Encoding Genes

WU Yi, GONG Hansheng*, LIU Wenli, LI Mingyue, WANG Huadong, WANG Junjuan
(College of Food Engineering, Ludong University, Yantai 264025, China)

OneLactobacillusstrain isolated from homemade cherry wine revealed significant inhibitory activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria using double plate punching method, which was named LD 1.0008. LD 1.0008 was identified asLactobacillus plantarumby its carbohydrate fermentation pattern using API 50 CHL test kits, 16S rDNA sequence analysis andrecA-based polymerase chain reaction (PCR) test. The antibacterial activity was significantly decreased after protease treatment, whereas it remained stable after treatment with catalase. The antibacterial substances were confirmed as bacteriocin after excluding the interference of organic acid. PCR amplification was carried out using previously reported 10-pair plantaricin primers. It was indicated that at least 4 bacteriocin-encoding genes could be produced by LD 1.0008, includingplnD,plnO,plnVandplnW. It is of great significance for the separation and application of plantaricins of LD 1.0008.

bacteriocin; Lactobacillus; identifi cation; bacteriocin-encoding genes

TS201.3

A

10.7506/spkx1002-6630-201511021

2014-07-01

國家自然科學基金青年科學基金項目（31301565）；山東省自然科學基金青年基金項目（ZR2012CQ009）；煙臺市科技計劃項目（2012125）；魯東大學科研基金項目（LY2010016）

吳軼（1993—），男，本科生，研究方向為食品微生物。E-mail：mbb_wuyi@163.com

*通信作者：貢漢生（1981—），男，副教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：hsgong_221@163.com