阻斷TLR4信號通路對結腸癌細胞CT26裸鼠種植瘤生長和凋亡的影響

何卉欣 蔣夢萍 劉慧玲 江潔 尉秀清

阻斷TLR4信號通路對結腸癌細胞CT26裸鼠種植瘤生長和凋亡的影響

何卉欣 蔣夢萍 劉慧玲 江潔 尉秀清

目的研究阻斷Toll樣受體4（TLR4）信號通路對小鼠結腸癌細胞CT26裸鼠種植瘤生長和凋亡的影響。方法 建立結腸癌細胞CT26裸鼠種植瘤模型，12只鼠成瘤后隨機分成實驗組及對照組，分別腹腔內注射TLR4信號通路阻斷劑CLI-095（3 mg／kg）和相同公斤體積的二甲基亞砜（DMSO），并測定種植瘤的生長曲線；種植瘤石蠟包埋切片作蘇木素-伊紅染色觀察病理組織學改變，TUNEL法檢測瘤組織凋亡情況，蛋白免疫印跡法檢測TLR4、cleaved caspase-3等蛋白表達。結果在實驗結束時，實驗組瘤體體積為（2.39±0.32）cm3，對照組瘤體體積為（1.77±0.25）cm3，實驗組瘤體顯著大于對照組（t＝3.817，P＝0.004）。實驗組腫瘤細胞排列較致密，僅有局部壞死；對照組腫瘤細胞密度較低、排列散亂，壞死顯著。實驗組癌組織凋亡指數(shù)為（9.86±2.80）%，明顯低于對照組的（22.57±4.93）%，t＝－7.091，P＜0.001。2組癌組織TLR4蛋白的表達無顯著差異，實驗組cleaved caspase-3蛋白的表達顯著低于對照組。結論阻斷TLR4信號通路，可以抑制結腸癌細胞株CT26種植瘤細胞的凋亡，從而有利于腫瘤生長。

結腸癌；TLR4；細胞凋亡；種植瘤

基礎研究論著

結腸癌是目前世界第三大常見惡性腫瘤，也是中國最常見的腫瘤及腫瘤相關死亡原因，但目前關于結腸癌的病因及其發(fā)病機制仍未完全明了［1-2］。新近研究表明，先天性免疫在結腸癌發(fā)病機制中起了非常重要的作用［3］。Toll樣受體4（TLR4）是一種非常重要的先天性免疫受體，其配體為外源性的脂多糖及內源性的熱休克蛋白60等，不僅在免疫細胞上表達，近年來發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細胞上也有表達并表達上調，如結直腸癌、胃癌、乳腺癌、肝細胞等［4-7］。TLR4在結腸癌中的具體作用及作用機制仍未明確，本研究擬用TLR4信號通路阻斷劑CLI-095腹腔注射于小鼠結腸癌細胞CT26裸鼠種植瘤模型，觀察其對種植瘤的生長和凋亡的影響，以期初步明確TLR4在結腸癌中的生物學作用，并探討其可能的作用機制［8］。

材料與方法

一、實驗細胞株及實驗動物

1.實驗細胞株

小鼠結腸癌細胞CT26購于中國科學院上海生命科學院細胞資源中心。

無特定病原體（SPF）級BALB／c Nude裸鼠12只，雄性，周齡5周，體質量16～20 g，購自中山大學北校區(qū)動物實驗中心。實驗過程中對動物的處理符合醫(yī)學倫理學的標準。

二、主要試劑

CLI-095（InvivoGen），蘇木素-伊紅染料（中杉金橋），TUNEL試劑盒（Recho），DMSO（Sigma），RPMI1640培養(yǎng)基（GIBCO），胎牛血清（GIBCO），0.025%胰蛋白酶（GIBCO），蛋白提取裂解液（EMD Millipore），蛋白質定量試劑盒（GenStar），cleavedcaspase-3抗體（Abcam），TLR4抗體（Abcam），β-actin抗體（Abcam）。

三、實驗方法

1.細胞傳代及培養(yǎng)

CT26于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中貼壁生長，放于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，以0.025%的胰蛋白酶消化，含血清培養(yǎng)基停止消化，1∶3傳代。收集對數(shù)生長期細胞，離心取上清，并用無血清培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)，調整細胞濃度，制成2×106／ml的單細胞懸液。

2.成瘤小鼠實驗模型建立

溫州方言的歷史面貌不見于或很少見于歷史文獻，甌越語方言語匯往往是歷史形成，世代口耳相傳，缺少書面文本，這也給語料收集、研究、匯錄增加了難度。盛教授為了寫這本書,通過大量的田野調查和文獻查詢，歷時近五年時間，比較全面地收集了甌越語成語、慣用語、歇后語、諺語等語匯。據(jù)粗略統(tǒng)計，全書共收集到甌語語匯4000多條，越語語匯3000多條。而這些材料是前人還沒有全面系統(tǒng)地收集、整理、研究過的，這為該書的寫作提供了豐富、翔實、可靠的語料。

小鼠隨機分成實驗組和對照組2組，每組6只。用一次性1 ml無菌注射器于每只小鼠右側腰部皮下接種0.2 ml CT26單細胞懸液，形成直徑約3 mm皮丘。待腫瘤出現(xiàn)肉眼可觀察后，隔天實驗組腹腔注射3 mg／kg CLI-095（以DMSO為溶劑）［8］，對照組注射與實驗組等公斤體積的DMSO溶液；同時觀察小鼠精神及飲食情況，測量2組小鼠腫瘤體積。計算腫瘤體積（v）的方法：v＝ab2／2 （a：腫瘤最大直徑，b：腫瘤最小直徑）。

3.標本采集與處理

第21日，10%水合氯醛麻醉小鼠后并剝離種植瘤體。每組每個標本取部分放入10%福爾馬林中固定制成石蠟標本，其余保存于液氮中用于提取蛋白質。

4.組織學分析及TUNEL檢測

病理標本常規(guī)石蠟包埋，蘇木素-伊紅染色，觀察種植瘤生長情況。按照Roche公司產品說明書進行TUNEL檢測，細胞核呈棕褐色為陽性染色。每張切片隨機選10個視野，計算凋亡細胞數(shù)及總細胞數(shù)，凋亡指數(shù)＝凋亡細胞數(shù)／腫瘤細胞總數(shù)×100%。

5.種植瘤蛋白提取及蛋白質電泳

每組取約20 mg凍存的瘤組織，按蛋白質提取裂解液說明書提取腫瘤組織總蛋白，并用BCA法檢測蛋白濃度。分離蛋白并進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜（PVDF膜）、封閉后，用相應目的蛋白的抗體孵育，4℃冰箱搖床過夜，其中對總蛋白分別用抗TLR4、cleaved caspase-3、β-actin的一抗孵育。次日復溫30 min后，HRP標記的二抗孵育2 h，暗房曝光。

四、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 19.0軟件進行相關數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，采用2組獨立樣本t檢驗進行假設檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、2組小鼠結腸癌細胞CT26種植瘤的觀察與比較

所有裸鼠接種后，均先后成瘤，成瘤率達100%，無自然死亡。成瘤期間，小鼠精神飲食可。肉眼見皮下種植瘤呈結節(jié)狀，質硬，邊界清，表面可見豐富血管形成，不易推動，向周圍浸潤性生長。接種細胞第21日完整剝取種植瘤，可見CLI-095實驗組腫瘤的體積顯著大于對照組。接種腫瘤單細胞懸液第5日出現(xiàn)肉眼可見約為0.05 cm3種植瘤開始腹腔注射藥物，17 d以前2組小鼠種植瘤體積差異無統(tǒng)計學意義。在第19日及第21日，實驗組種植瘤體積分別為（1.74±0.35）cm3和（2.39±0.32）cm3，對照組種植瘤體積為（1.29 ±0.22）cm3和（1.77±0.25）cm3，實驗組瘤體體積顯著高于對照組，2組比較差異均有統(tǒng)計學意義（t第19日＝2.657，P＝0.03；t第21日＝3.817，P＝0.004），見圖1、2。

圖1 小鼠的腫瘤生長曲線

圖2 小鼠皮下種植瘤大體標本

二、2組小鼠結腸癌細胞CT26種植瘤石蠟切片組織學情況及凋亡情況

蘇木素-伊紅染色可見2組鼠CT26結腸癌種植瘤細胞布滿視野，密集排列，無顯著腺體存在，癌細胞間有結締組織。腫瘤細胞異型性顯著，核大畸形、深染，胞質少，大小不一，形狀不等，呈橢圓形，病理性核分裂像多見。與對照組比較，實驗組腫瘤組織壞死灶少，腫瘤細胞密度較高。TUNEL染色顯示凋亡信號散在于腫瘤組織。實驗組凋亡指數(shù)為（9.86±2.80）%，顯著低于對照組的（22.57±4.93）%，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（t＝－7.091，P＜0.001），實驗組凋亡信號少呈淡褐色，對照組凋亡信號分布廣泛且呈深褐棕色（圖3）。

圖3 CT26結腸癌種植瘤石蠟切片組織學表現(xiàn)及凋亡情況（×200）

三、種植瘤組織中的TLR4及cleaved caspase-3蛋白的表達

3組腫瘤組織蛋白免疫印跡法檢測，內參照βactin為均一顯影的條帶，TLR4蛋白表達量無差異；實驗組cleaved caspase-3蛋白表達量顯著降低，這與TUNEL法檢測的結果趨勢相一致（圖4）。

圖4 結腸癌細胞CT26種植瘤相關蛋白質表達情況

討 論

結腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，各地流行病學資料顯示，結腸癌發(fā)病率及病死率均逐年上升。由于慢性炎癥是腫瘤一個非常重要的危險因素，近年來研究發(fā)現(xiàn)，參與介導炎癥的TLR4可促進炎癥相關結腸癌腫瘤發(fā)展；另一方面，促腫瘤細胞分泌炎癥因子逃避自然殺傷細胞核細胞毒性T細胞攻擊，進而加強免疫逃逸作用［9-10］。但同時也有證據(jù)指出活化TLR4發(fā)揮著抗癌作用。在腫瘤發(fā)展中，TLR4促樹突狀細胞的成熟及自然殺傷細胞的活化，誘發(fā)或上調T細胞介導的抗腫瘤特異性免疫［11］。目前包括TLR4的配體內毒素（LPS）以及另外2 種TLR4的激動劑牛型結核桿菌卡介苗以及沙培林（OK-432）已被證明是治療結腸癌、胃癌和肺癌的有效藥物［12-15］。Eiró等［16］對104位結腸癌患者臨床研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞表達TLR4的患者腫瘤復發(fā)率更低、生存期更長。Li等［17］繁育轉基因APCMin／＋小鼠，其腸上皮細胞可持續(xù)表達活化TLR4，并發(fā)現(xiàn)此類轉基因小鼠較雜合小鼠自發(fā)腸道腫瘤率減少且腫瘤體積減小，誘導激活凋亡通路，抑制腫瘤的發(fā)展。以上研究表明，TLR4在腫瘤發(fā)展中的作用是非常復雜的，需要我們進一步研究。

CLI-095是TLR4的特異性抑制劑，通過結合TLR4胞內的Cys747位點從而阻斷TLR4信號通路，故本實驗用CLI-095腹腔內注射于CT26裸鼠種植瘤模型來探索體內TLR4信號阻斷對腫瘤細胞凋亡的影響。本實驗發(fā)現(xiàn)，實驗組瘤體顯著大于對照組。實驗組切片中，腫瘤細胞密度高成片排列，核大質少，僅出現(xiàn)局部壞死；對照組切片中，腫瘤細胞密度較低、排列散亂，多見部分細胞出現(xiàn)空泡或者核固縮，壞死顯著。TUNEL法發(fā)現(xiàn)，實驗組癌組織凋亡指數(shù)顯著低于對照組；蛋白免疫印跡法檢測表明，2組的TLR4表達未有顯著差異，而實驗組cleaved caspase-3表達顯著低于對照組，這與TUNEL法的結果一致；這些結果均提示誘導細胞凋亡可能是TLR4信號抑制種植瘤的作用機制之一。

綜上所述，在結腸癌細胞CT26裸鼠種植瘤模型上這一體內實驗條件下，阻斷TLR4信號通路，可以抑制種植瘤細胞發(fā)生凋亡，從而促進腫瘤生長。這為闡明TLR4誘導結腸癌細胞凋亡的分子信號機制提供了初步實驗依據(jù)，但確切機制仍有待進一步探討。

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Effect of blocking TLR4 signaling pathway on the growth and apoptosis of tumors of colorectal cancer cell line CT26 implanted in nude mice

He Huixin，Jiang Mengping，Liu Huiling，Jiang Jie，Wei Xiuqing. Department of Gastroenterology，the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China

ObjectiveTo investigate the effect of blocking TLR4 signaling pathway on the growth and apoptosis of the tumors of colorectal cancer cell line CT26 implanted in nude mice.Methods Twelve nude mouse models implanted with colorectal cancer cell line CT26 were established and randomly divided into the treatment and control groups.In the treatment group，the animals were injected with CLI-095（3 mg／kg），a TLR4 signaling pathway blocker and those in the control group were injected with the equivalent dose of DMSO.Growth curves of the implanted tumors were measured.Pathological changes of the implanted tumors were observed by HE staining.The apoptosis of the implanted tumors was detected by TUNEL staining.The expression levels of TLR4，cleaved caspase-3 and alternative proteins were determined by Western blot.ResultsMean tumor size in the treatment group was（2.39±0.32）cm3，significantly larger than（1.77±0.25）cm3in the control group（t＝3.817，P＝0.004）.The tumor cells in the treatment group were arranged at a high density and merely partial necrosis was observed，whereas those in the control group were distributed at a low density in disorder and severe necrosis was noted.In the treatment group，the apoptosis index of tumor tissues was（9.86±2.80）%，significantly lower compared with（22.57±4.93）%in the control group（t＝－7.091，P＜0.001）.The expression of TLR4 protein in tumor tissue did not significantly differ between two groups（P＞0.05），whereas the expression of cleaved caspase-3 protein in the treatment group was significantly lower than that in the control group.ConclusionBlocking TLR4 signal pathway can inhibit the apoptosis of the tumors of colorectal cancer cell line CT26 impalnted in nude mice and promote the growth of tumors.

Colorectal cancer；TLR4；Apoptosis；Implanted tumor

2014-12-06）

（本文編輯：楊江瑜）

10.3969／g.issn.0253-9802.2015.04.003

國家自然基金面上項目（81470848，81272640）

510630廣州，中山大學附屬第三醫(yī)院消化內科

，尉秀清，E-mail：wei-xiuqing＠163.com