超濾技術去除羥基喜樹堿中細菌內毒素的研究

【摘 要】本實驗采用超濾技術去除羥基喜樹堿中的細菌內毒素。超濾后有效成分透過率為96.2%。超濾后細菌內毒素的去除效果：細菌內毒素去除率為96.0%。實驗結果表明此方法可用于羥基喜樹堿中細菌內毒素的去除。

【關鍵詞】超濾技術；羥基喜樹堿；研究

羥基喜樹堿是從我國特有的珙垌科喬木―喜樹中分離提取的一種微量生物堿。羥基喜樹堿抗癌機制獨特，通過選擇性的抑制拓撲異構酶I而干擾DNA的復制，具有高效低毒、廣譜抗癌的特點，與其它常用抗腫瘤藥物無交叉耐藥性，對多種抗藥性腫瘤仍然有效[1-2]。羥基喜樹堿是目前從喜樹中分離的20多個單體中抗癌作用最強的化合物。羥基喜樹堿臨床用于膀胱癌、直腸癌、肝癌、白血病及頭頸部腫瘤等[3-9]。超濾技術是通過膜表面的微孔結構對物質進行選擇性分離，從而實現大、小分子的分離、濃縮、凈化的目的。超濾技術具有濾過程是在常溫下進行，條件溫和無成分破壞；濾過程不發生相變化；能耗低；超濾技術分離效率高；流程短；操作簡便；易于控制和維護等特點。本實驗采用超濾技術去除羥基喜樹堿中的細菌內毒素。

1.儀器與試藥

P230高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）； ABS220-4分析天平（德祥科技有限公司）；板框超濾膜（海寧市桃沅膜分離廠，截留分子量MWCO=10kDa）；QTR3120基本加熱型超聲波清洗器（天津市瑞普電子儀器公司）；BET-72細菌內毒素測定儀（天大天發科技有限公司）；LPD2500多管漩渦混合儀（萊普特科學儀器（北京）有限公司）；XYG-H帕恩特痕量分析級超純水機（北京湘順源科技有限公司）；10L大型旋轉蒸發儀（北京賽美思儀器設備有限公司）；KHW-D-1LC精密拉伸水浴鍋（上海科恒實業發展有限公司）；SHB-III 循環水真空泵（西安中諾儀器有限公司）；BT100-01蠕動泵（保定齊力恒流泵有限公司）；TGL20MW臺式大容量高速冷凍離心機（湖南赫西離心機儀器有限公司）；0.5平米板框式超濾器（吉林敖騰生物科技有限責任公司）；DGG-9030A電熱鼓風干燥箱（北京鴻達天矩試驗設備有限公司）。動態濁度法鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司）；細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院）；細菌內毒素檢查用水（石家莊啟迪科技有限公司）；細菌內毒素指示劑（北京欣惠澤奧科技有限公司）。

2.含量測定

2.1色譜條件

依據查閱文獻及考查的結果，確定色譜條件如下[10-12]。色譜柱為依利特hypersil BDSC18色譜柱（4.6*250*5u）；甲醇-水（85：15）為流動相；檢測波長為266nm；流速1.0mL·min-1；柱溫：30℃。

2.2供試品溶液的制備

取羥基喜樹堿適量，精密稱取，置50mL量瓶中，加流動相適量，超聲提取20分鐘，放置至室溫，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3對照品溶液的制備

精密稱取羥基喜樹堿對照品約10mg，置100mL容量瓶中，用流動相超聲波振蕩溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.實驗方法

3.1供試樣品溶液的制備

稱取羥基喜樹堿1克，用100毫升注射用水溶解，加人細菌內毒素適量，混勻，作為原液，標識備用。取上述配制好的藥液原液以10 kDa分子量超濾膜進行試驗。分別取藥液原液和超濾液檢測其中細菌內毒素的含量。

3.2細菌內毒素的檢測

3.2.1標準曲線的制作

分別配內毒素濃度為2.0、0.5、0.125、0.03125EU/mL的標準溶液，各取0.1毫升分別加到預先加有0.1毫升鱟試劑溶液的反應管內，混合均勻，進行檢測并同時作陰性對照2管。以反應時間t的對數為縱坐標，細菌內毒素濃度C為橫坐標，按最小二乘法進行統計分析，得標準曲線。

3.2.2干擾實驗及內毒素定量測定

分別將各樣品藥液用細菌內毒素檢查用水稀釋，以此稀釋液作為供試液，同時分別將此倍數稀釋液配制成含內毒素標準品0.5EU/mL的溶液，作為陽性對照。分別取上述溶液0.1毫升加到預先加有0.1毫升鱟試劑反應管內，混勻，進行檢測。

4.結果與討論

細菌內毒素，英文稱作Endotoxin，是G-菌細胞壁個層上的特有結構，內毒素為外源性致熱原，它可激活中性粒細胞等，使之釋放出一種內源性熱原質，作用于體溫調節中樞引起發熱。細菌內毒素是革蘭氏陰性菌的細胞壁成分，當細菌死亡或自溶后便會釋放出內毒素。因此，細菌內毒素廣泛存在于自然界中。內毒素通過注射等方式進入血液時則會引起不同的疾病。內毒素小量入血后被肝臟枯否細胞滅活，但大量內毒素進入血液就會引起發熱反應。因此，生物制品類、注射用藥劑、化學藥品類、疫苗類、透析液等制劑必須經過細菌內毒素檢測試驗合格后才能使用。細菌內毒素具有耐熱性和化學穩定性，不易被去除，目前注射劑生產常用活性炭吸附法去除熱原，但去除效率并不能保證。本實驗采用超濾技術去除羥基喜樹堿中的細菌內毒素。超濾后有效成分的變化：原液（超濾前）高效液相測定含量為98.62EU/ml，總量為1克，有效成分量為98.61克，超濾后高效液相測定含量為99.09EU/ml，總量為0.98克，有效成分量為94.83克，透過率為96.2%。超濾后細菌內毒素的去除效果：原液細菌內毒素濃度為7.5216EU/ml，超濾后細菌內毒素濃度為0.3003EU/ml，細菌內毒素去除率為96.0%。超濾技術可以很好的去除羥基喜樹堿原料藥溶解液中細菌內毒素，有效成分損失極其微少，可提高其用藥安全性。

【參考文獻】

[1]吳永芳，袁云，毛松柏.羥基喜樹堿并用丹參治療消化系癌的療效觀察[J].癌癥，1990（03）.

[2]黃慧強，姜文奇，胡曉樺，林旭濱，劉魁鳳，李宇紅，林忠，申維璽，陳強，何友兼，管忠震；羥基喜樹堿凍干粉針（拓僖）單藥治療晚期惡性腫瘤臨床研究的初步報告[J].癌癥，2003（12）.

[3]周軍，樊亦軍，陳定南，梁灼，楊婉玲.喜樹堿（CPT）與10—羥基喜樹堿（HCPT）的抗腫瘤活性與毒性比較[J].癌癥，1991（03）.

[4]李立源，張冬艷，白鳳武.喜樹堿及其衍生物的研究進展[J].大連民族學院學報，2001（02）.

[5]董生，肖湘生，陳慶華，陸偉根，剛憲禎.羥基喜樹堿明膠微球肝動脈化療栓塞治療肝腫瘤的實驗研究[J].實用放射學雜志，1998（02）.

[6]沈靖南.腫瘤藥敏預測試驗與臨床化療效應相關性的研究概況[J].癌癥，1994（06）.

[7]張力，李蘇，廖海，姜文奇，管忠震.羥基喜樹堿Ⅰ期藥代動力學及人體耐受性臨床研究[J].癌癥，2001（12）.

[8]李蘇，姜文奇，張力，廖海，管忠震.羥基喜樹堿（HCPT）不同給藥方式的藥理學比較[J].中國臨床藥理學雜志，2001（06）.

[9]董生，肖湘生，郝楠馨.羥基喜樹堿明膠微球肝動脈化療栓塞治療原發性肝癌[J].中國醫學計算機成像雜志，1999（01）.

[10]彭茗，陸丹，劉瑾，楊永健.HPLC同時測定羥喜樹堿注射液的有關物質及含量[J].中國現代應用藥學，2011（09）.

[11]路偉，張志榮，劉濱.高效液相色譜法測定兔血漿中羥基喜樹堿的含量[J].廣東藥學，1999（04）.

[12]婁志紅，孫煌，姜連閣，白政忠.HPLC法測定羥喜樹堿注射液中有關物質[J].藥物分析雜志，2009（03）.