碳納米管/二氧化硅的表面分子印跡聚合物制備及其在蘆丁電化學檢測方面的應用

唐 婷，湯傳貴，曾延波，李 蕾，潘樣丹，徐啟翔，肖平秀，葉冰青

(嘉興學院 生物與化學工程學院，浙江 嘉興 314001)

蘆丁(又名蕓香堿)作為藥物有降低毛細血管通透性和脆性的作用［1］，可保持及恢復毛細血管的正常彈性，常用于高血壓腦溢血、視網膜出血、急性出血性腎炎和再發性鼻出血等的輔助治療。建立快速、方便和準確的測定蘆丁含量的方法具有重要意義。蘆丁的檢測主要采用電化學傳感器［2－5］、高效液相色譜［6］、分光光度［7］等方法。電化學方法因靈敏度高、儀器設備簡單、成本低等優點常用于蘆丁含量的測定。

分子印跡是以目標分子為模板分子，制備具有固定空穴大小、有確定排列功能團的交聯聚合物［8－12］的技術。表面分子印跡技術是制備基于載體的印跡聚合物材料，其印跡位點位于材料的表層，可提高目標分子的識別響應速度、降低非特異性吸附，同時易獲得一定的物理性質，以解決傳統印跡聚合物模板分子去除困難、印跡位點較少和傳質速度慢等問題［13－14］。碳納米管用作分子印跡載體時，在聚合前需進行烯基功能化，其烯基功能化主要采用酰氯化、酰胺化法合成［15－16］，而采用溶膠凝膠法制備烯基碳納米管的文獻報道相對較少。基于蘆丁的碳納米管表面分子印跡聚合物的制備及其電化學傳感器研究未見報道。

本文以3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷修飾的二氧化硅碳納米管(MAPS－CNTs/SiO2)為分子印跡載體，蘆丁為模板分子，丙烯酰胺為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，采用自由基聚合法制備CNTs/SiO2－MIPs，并采用紅外光譜、掃描電鏡和熱重分析等手段對CNTs/SiO2－MIPs進行表征，將CNTs/SiO2－MIPs滴涂至玻碳電極表面構建傳感器，采用循環伏安法和差分脈沖伏安法對CNTs/SiO2－MIPs修飾電極的電化學行為進行考察，研究了修飾電極對蘆丁的選擇性、吸附性，并將CNTs/SiO2－MIPs分子印跡傳感器應用于藥片中蘆丁含量的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

S－4800掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)，STA－409PC熱重分析儀(德國耐馳儀器制造有限公司)，NEXUS470紅外光譜儀(美國Nicolet公司)。CHI660D電化學工作站(上海辰華儀器公司);三電極體系:裸玻碳電極(GCE，直徑3 mm)或修飾GCE為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極。

羧基化碳納米管(CNTs－COOH)(深圳市納米港有限公司)，蘆丁(上海國藥集團化學試劑有限公司)，丙烯酰胺、四乙氧基硅烷(TEOS)、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MAPS)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、槲皮素、柚皮素、山奈酚、抗壞血酸(阿拉丁試劑有限公司)，復方蘆丁片(每片中含有20 mg蘆丁)由上海朝暉藥業有限公司生產。其它試劑均為分析純，實驗用水為超純水。磷酸鹽緩沖液(PBS，0.1 mol/L)由NaH2PO4和Na2HPO4配制而成。

1.2 MAPS－CNTs/SiO2的合成

CNTs/SiO2－MIPs的制備及其用于蘆丁的電化學檢測如圖1所示。取250.0 mg CNTs－COOH、0.5 mL APTES和100.0 mg十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)分散于48.0 mL H2O中，40℃下超聲20 min后，攪拌3 h，得溶液A;取5.0 mL TEOS和3.0 mL H2O分散于50.0 mL乙醇中，40℃下超聲20 min后，攪拌3 h，得溶液B。將溶液A與B混合，于40℃下超聲60 min，再磁力攪拌10 min;用質量分數為25%的氨水調至pH 9.5，磁力攪拌12 h，產物依次用水、乙醇洗滌3次，在65℃下真空干燥12 h后得到二氧化硅包覆的碳納米管(CNTs/SiO2)。將100.0 mg CNTs/SiO2分散在50.0 mL無水甲苯中，然后加入10.0 mL MAPS，N2保護下120℃回流24 h，產物依次用甲苯、乙醇分別洗滌3次，65℃下真空干燥12 h得到MAPS－CNTs/SiO2。

1.3 CNTs/SiO2－MIPs的合成

在100 mL圓底燒瓶內，將166.1 mg蘆丁分散到50.0 mL四氫呋喃中，加入80.0 mg MAPSCNTs/SiO2和71.1 mg丙烯酰胺(AAm)，磁力攪拌30 min進行預聚合反應，再加入942.9 μL EGDMA和20.0 mg AIBN，通入氮氣15 min后封好燒瓶口，在65℃油浴下反應24 h，產物用甲醇－乙酸(體積比9∶1)混合溶劑進行索氏提取以除去模板分子，65℃下干燥12 h后制得CNTs/SiO2－MIPs。

除不加模板分子外，采用相同方法制備非印跡聚合物CNTs/SiO2－NIPs。

圖1 CNTs/SiO2－MIPs的制備及其對蘆丁的電化學檢測Fig.1 Preparation for CNTs/SiO2－MIPs and its application in detection of rutin

1.4 修飾電極的制備

玻碳電極依次用0.3，0.05 μm Al2O3粉末拋光處理后，分別用無水乙醇、水超聲清洗10 min，備用。20.0 mg CNTs/SiO2－MIPs(或CNTs/SiO2－NIPs)加至1 mL 0.5%的殼聚糖溶液中，超聲混合均勻，取該混合溶液5.0 μL涂滴至處理好的裸玻碳電極表面，室溫下晾干。將CNTs/SiO2－MIPs/GCE(或CNTs/SiO2－NIPs/GCE)置于含有蘆丁的5 mL 0.1 mol/L PBS(pH 4.5)中，攪拌吸附7 min，用水沖洗修飾電極后，將修飾電極置于空白PBS溶液中進行循環伏安法(CV)和差分脈沖伏安法(DPV)檢測。

2 結果與討論

2.1 CNTs/SiO2－MIPs的表征

2.1.1 紅外光譜及熱重分析 CNTs/SiO2－MIPs的紅外光譜如圖2A所示;CNTs－COOH在3 441 cm－1的吸收峰屬于羧基的O—H伸縮振動(曲線a);CNTs/SiO2位于428，792，1 083 cm－1處的吸收峰，分別屬于Si—O—Si的彎曲振動、對稱振動和不對稱振動(曲線b);對于MAPS－CNTs/SiO2出現在1 725 cm－1處的峰，屬于MAPS上C‖O的伸縮振動峰(曲線c)，說明MAPS成功地接枝到CNTs/SiO2表面;CNTs/SiO2－MIPs的紅外圖譜中出現了MIPs的1 728，1 251，1 155 cm－1的吸收峰(曲線d)，同時還保留著MAPS－CNTs/SiO2的吸收峰，如428，792，1 083 cm－1，說明CNTs/SiO2－MIPs已成功制備。

圖2 不同材料的紅外光譜(A)和熱重分析曲線(B)Fig.2 FTIR spectra(A)and TGA curves(B)of different materials

熱重分析如圖2B所示，CNTs－COOH在25～600℃較穩定(曲線a)，只有較小的質量損失，該損失歸因于羧基分解;MAPS－CNTs/SiO2損失約為10%(曲線b)，說明SiO2具有較好的熱穩定性;但CNTs/SiO2－MIPs的質量損失約為85%(曲線c)，主要來自MIPs的碳骨架分解。熱重分析表明MIPs已聚合至MAPS－CNTs/SiO2。

2.1.2 掃描電鏡圖 CNTs－COOH，MAPS－CNTs/SiO2和CNTs/SiO2－MIPs的掃描電鏡如圖3所示。CNTs－COOH呈管狀(圖A)，直徑約為35 nm;二氧化硅包覆碳納米管和MAPS鍵合后，MAPSCNTs/SiO2管的直徑約為145 nm(圖B);CNTs/SiO2－MIPs管的直徑約為170 nm(圖C)，說明碳納米管表面形成了一層聚合物材料。

圖3 材料的掃描電鏡圖Fig.3 SEM images of different materials

2.2 修飾電極的電化學表征

在 5 mmol/L K3［Fe(CN)6］ 和 0.1 mol/L KCl的混合溶液中，采用循環伏安法對不同材料的修飾電極進行電化學表征(圖4)。由圖可見，CNTs－COOH/GCE的氧化還原電流響應最大(曲線a)，CNTs－COOH接上MIPs后電流響應略有降低(曲線b)，這可歸因于CNTs－COOH的電催化活性好于 MIPs，MIPs相對 CNTs－COOH會阻礙電子傳遞，所以洗脫模板分子后的CNTs/SiO2－MIPs修飾電極的電流響應降低。由于SiO2的導電性差，MAPS－CNTs/SiO2/GCE的氧化還原峰電流響應降低(曲線c)，CNTs/SiO2－NIPs/GCE的氧化還原峰電流響應比MAPS－CNTs/SiO2/GCE小(曲線d)，這是由于沒有空穴位點的非印跡膜覆蓋電極表面，阻礙了電極表面的電子傳遞。印跡電極在未去除模板分子前，由于模板分子的阻礙，［Fe(CN)6］3－/4－的氧化還原反應響應較小(曲線e)，但大于裸玻碳電極的電流響應(曲線f);而去除模板分子蘆丁后的CNTs/SiO2－MIPs/GCE由于具有空穴位點的印跡膜覆蓋了電極表面，促進了電極表面的電子傳遞，其氧化還原峰電流響應明顯增大(曲線b)，說明表面印跡材料的識別位點可以加快 ［Fe(CN)6］3－/4－在電極表面的擴散，從而促進 ［Fe(CN)6］3－/4－的氧化還原反應。

圖4 不同修飾電極的循環伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of different modified electrodes

2.3 實驗條件的優化

固定蘆丁的濃度為50.0 μmol/L，采用DPV法考察吸附時間、PBS吸附液pH值對CNTs/SiO2－MIPs/GCE峰電流響應的影響。結果顯示，隨著吸附時間增大，分子印跡修飾電極對蘆丁的電流響應也增大，3 min時達到最大電流響應的58.3%，7 min時響應電流達到最大，所以選擇吸附時間為7 min。當PBS吸附液的pH值在3.0～4.5范圍內，響應電流隨pH值的增大而增大，當pH值大于4.5時，電流響應反而減小，因此實驗選擇最佳pH值為4.5。

2.4 傳感器的分析特性

2.4.1 修飾電極對蘆丁的電化學行為 將CNTs/SiO2－MIPs/GCE和CNTs/SiO2－NIPs/GCE浸入含有50.0 μmol/L蘆丁的PBS溶液中，吸附7 min后，在空白PBS溶液中進行CV與DPV檢測，以考察分子印跡和非印跡修飾電極對蘆丁電流響應的影響(見圖5)。結果顯示，CNTs/SiO2－MIPs/GCE和CNTs/SiO2－NIPs/GCE對蘆丁的電流響應相差約3倍，印跡材料的DPV電流響應是非印跡材料的2.84倍;這歸因于CNTs/SiO2－MIPs形成了與模板分子尺寸大小、結構功能相匹配的印跡空穴，從而可對蘆丁產生特異性吸附。

圖5 不同電極吸附50.0 μmol/L蘆丁后的循環伏安圖(A)與差分脈沖伏安圖(B)Fig.5 Cyclic voltammograms(A)and differential pulse voltammograms(B)of different electrodes after incubating in 50.0 μmol/L rutin solution

2.4.2 傳感器的選擇性 為了研究CNTs/SiO2－MIPs和CNTs/SiO2－NIPs對蘆丁的選擇性，考察了CNTs/SiO2－MIPs和CNTs/SiO2－NIPs修飾的電化學傳感器對50.0 μmol/L的蘆丁、槲皮素、柚皮素、抗壞血酸等類似物的選擇性。結果表明，CNTs/SiO2－MIPs修飾電極對蘆丁的電流響應分別為槲皮素、柚皮素、抗壞血酸的4.15，5.74，4.88倍，而非印跡電極對蘆丁以及類似物的電流響應相差較小。表明CNTs/SiO2－MIPs對蘆丁具有較好的選擇性，說明CNTs/SiO2－MIPs形成了與蘆丁尺寸大小相同、結構功能相匹配的印跡空穴。

2.4.3 線性范圍、檢出限、重現性及穩定性 在最優條件下，采用DPV法研究了CNTs/SiO2－MIPs/GCE對蘆丁的檢測性能。如圖6所示，隨著蘆丁濃度的增大，在0.4 V處的峰電流不斷增加，其峰電流的大小與蘆丁濃度在0.1～100.0 μmol/L范圍內呈良好的線性關系，線性方程為I(μA)=0.016 3+0.007 37c(μmol/L)，相關系數為0.999 2，該方法所得蘆丁的檢出限(S/N=3)為0.032 μmol/L。將本方法與其它測定蘆丁的電化學方法進行對比［17－21］，該方法具有較寬的線性范圍和較低的檢出限(見表1)。

采用 CNTs/SiO2－MIPs/GCE 對50.0 μmol/L的蘆丁連續測定6次，相對標準偏差(RSD)為3.9%。將CNTs/SiO2－MIPs/GCE在4℃存放2周后測定50.0 μmol/L蘆丁，響應電流為原始電流的95.2%。表明該電極具有較好的重現性和穩定性。

2.4.4 干擾實驗 研究了有機物對5.0 μmol/L蘆丁測定的影響。允許干擾量引起峰電流大小的改變在±5%范圍內。結果表明，500倍的葡萄糖，75倍的L-脯氨酸、L-胱氨酸，50倍的色氨酸、L-丙氨酸、組氨酸，以及20倍的L-半胱氨酸、山奈酚對蘆丁的檢測不產生干擾。表明CNTs/SiO2－MIPs/GCE的測定干擾較小，具有較好的選擇性。

圖6 CNTs/SiO2－MIPs/GCE傳感器對蘆丁的DPV響應曲線Fig.6 DPV current response curves at CNTs/SiO2－MIPs/GCE with addition of increasing concentration of rutin insert:calibration curve of rutin determination obtained by CNTs/SiO2－MIPs/GCE;concentration of rutin(a－j):0，0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，25.0，50.0，75.0，100.0 μmol/L

表1 本方法與其它測定蘆丁的電化學法對比Table 1 Comparison with other electrochemical methods for the determination of rutin

2.5 實際樣品的檢測

稱取1片復方蘆丁片(每片含有20 mg蘆丁)用研缽研碎，稱取20.0 mg粉碎后的蘆丁藥片，加入3.0 mL乙醇，超聲萃取，離心，得上層含蘆丁的乙醇液，取20 μL上層乙醇液加入5.0 mL PBS，將CNTs/SiO2－MIPs/GCE在上述溶液中攪拌吸附7 min后，在空白PBS中進行DPV測定，平行5次。測得1片復方蘆丁片中蘆丁的平均值為19.7 mg，RSD為3.6%。結果表明CNTs/SiO2－MIPs/GCE可用于藥片中蘆丁含量的測定。

3 結論

本文以MAPS－CNTs/SiO2為分子載體，蘆丁為模板分子，丙烯酰胺為功能單體，EGDMA為交聯劑，采用表面分子印跡技術制備CNTs/SiO2－MIPs/GCE電化學傳感器。實驗結果表明，CNTs/SiO2－MIPs對蘆丁具有良好的特異性吸附性能，印跡材料的DPV電流響應是非印跡材料的2.84倍;相對于其它類似的分子(如槲皮素、柚皮素、抗壞血酸)，CNTs/SiO2－MIPs傳感器對蘆丁具有較好的選擇性以及較高的靈敏度，該方法已成功應用于藥片中蘆丁含量的測定。

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