瘤胃纖毛蟲的殼多糖酶

（青島科技大學化工學院，山東青島266042）

1 介紹

瘤胃中的原蟲能迅速吞沒真菌孢子，這些孢子在角素中大量存在[1]。我們還發(fā)現，纖毛蟲能消化和發(fā)酵角素[2]。但是，一些種類的瘤胃原蟲的有關殼多糖酶信息還不完全。本研究的目的是將纖毛蟲的這些殼聚糖酶進行識別和特征描述。

2 材料和方法

Dogiel[3]識別出了纖毛蟲E.maggii,它們是從天然綿羊種群的瘤胃中分離出來。這些纖毛蟲根據Michslowski等[4]提出的方法在體外培養(yǎng)，然后被注射到沒有纖毛蟲的綿羊的瘤胃中[5]。生活在單一動物區(qū)系的綿羊的瘤胃中的纖毛蟲會繼續(xù)它們的酶工作。液體樣品取自瘤胃，其中的原蟲被分離出來并經離心純化[6]。純化后的纖毛蟲在抗生素混合物（氯霉素、鏈霉素、氨芐青霉素）中進行過夜孵化，每種物質的濃度為50μg/mL。使用抗生素的目的是為了限制細胞內細菌的生長。孵化后，用溫熱的鹽水（40℃）對纖毛蟲清洗三次[7]。最后，對它們進行離心法濃縮并在-80℃下儲存。為了制備酶制劑，我們將冰凍的纖毛蟲融化并放在一個含有研棒的高速攪拌器中進行均化。所得的均化物經過離心（22,000×g，30min，4℃）處理，將浮在表面的物質收集起來作為粗酶制劑。在粗酶中孵化出來的羧甲基角素會產生糖[8]，內殼多糖酶的活性是由羧甲基角素釋放的這些糖減少的數量來確定的。反應混合物包含0.4mL培養(yǎng)基、0.4mL酶制劑和0.2mL的0.1mol/L的檸檬酸鹽—硫酸鹽緩沖液。混合物于40℃下孵化1min，所釋放的物質根據Miller等[9]提出的方法用光譜光度測量法進行檢測。外殼多糖酶和β-N-乙酰基葡萄糖苷酶的活性是通過測量硝基苯的數量來確定的，這些硝基苯是由粗酶制劑分別作用于對4-硝基-N,N-二乙酰基-D-殼二糖和4-硝基苯-β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷而產生的。反應混合物包括濃度為1μmol/L的培養(yǎng)基溶液100μL，50μL酶制劑和150μL 0.1mol/L的檸檬酸鹽-硫酸鹽緩沖液。混合物于40℃下孵化1h，根據Yem和Wu[10]提出的方法進行定量測量。對粗酶制劑進行聚丙烯酰胺電泳（PAGE），再加上酶譜分析，可以識別出角素降解酶[8]。羧甲基-角素，4-甲基香豆素-β-D-N,N-二乙酰基殼二糖和4-甲基香豆素-N-乙酰基-β-氨基葡萄糖作為特定物質加入到培養(yǎng)基中，用于分離凝膠以識別內殼多糖酶，外殼多糖酶和β-N-乙酰基葡萄糖苷酶。

表1 E.maggii殼多糖酶的特性

3 結果和討論

我們的研究表明E.maggii纖毛蟲擁有內殼多糖酶，外殼多糖酶和β-N-乙酰基葡萄糖苷酶，是這些酶催化角素降解得到的。這個發(fā)現支持了關于殼多糖性質的早期研究結果[11]。他們的結果也表明最具活性的是β-N-乙酰基葡萄糖苷酶。其活性是Williams等[12]在E.mggii中發(fā)現的類似的酶的活性的12倍。內殼多糖酶和外殼多糖酶的活性相似（p＞0.05）,它們大約只有β-N-乙酰基葡萄糖苷酶的活性的一半（見表1）。

圖1 根據酶譜技術識別出的瘤胃纖毛蟲E.maggii的殼多糖酶；用PAGE法分離出原蟲蛋白質。

總之，六個蛋白質帶展示了它們對角素的降解能力或者說是它們的降解物數量（圖1）。兩個是來自內殼多糖酶，兩個來自外殼多糖酶，還有兩個來自β-N-乙酰基葡萄糖苷酶。

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