微柱凝膠法在不規則抗體特異性鑒定中的應用

粟明麗

【摘要】 目的：探討微柱凝膠法在血型不規則抗體特異性鑒定中的應用。方法：分別用鹽水法、抗人球蛋白法、微柱凝膠法對筆者所在醫院64例不規則抗體陽性患者進行抗體特異性鑒定。結果：鹽水法檢出2例抗體，抗人球蛋白法檢出55例抗體，微柱凝膠法檢出62例抗體。其中Rh系統抗體24例，MNSs系統11例，Lewis系統9例，Diego系統2例，抗-E聯合抗-Mur 1例，未確認抗體特異性17例。結論：微柱凝膠法應用于不規則抗體特異性鑒定敏感性高、特異性強，操作簡便、快捷，結果判讀清晰易于標準化。

【關鍵詞】 微柱凝膠法； 抗人球蛋白法； 不規則抗體； 抗體特異性

不規則抗體是指抗A、抗B以外的血型抗體，在臨床上易引起輸血不良反應、新生兒溶血病、血型鑒定及交叉配血困難等。輸血前對受血者進行血型不規則抗體篩選、特異性鑒定及交叉配血試驗，是確保臨床輸血安全和有效的重要措施。筆者所在醫院采用鹽水法、抗人球蛋白法、微柱凝膠法對擬輸血和手術的患者進行血型不規則抗體篩選，對結果陽性者再進行抗體特異性鑒定，為患者選擇相應抗原陰性及交叉配血試驗相合的血液進行輸注，保證了臨床輸血治療的安全性和有效性。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選自筆者所在醫院2012年10月-2014年2月住院申請輸血和手術備血的7596例患者篩查出的不規則抗體陽性64例，年齡26～85歲，男16例，女48例，有輸血史或妊娠史者52例，無輸血史或妊娠史者12例。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 全自動血型與配血分析系統（強生公司）；Diana微柱凝膠抗球蛋白卡、低離子介質溶液、專用孵育器、離心機（西班牙黛安娜公司）；KA-2200離心機（日本九保田公司）；上海產的電熱恒溫水浴箱。抗人球蛋白試劑、抗體篩選細胞、譜細胞、抗M抗體、抗P1抗體、抗C抗體、抗c抗體、抗D抗體、抗E抗體、抗e抗體、2-Me試劑（上海血液生物醫藥有限責任公司）；試劑均批檢合格并在有效期內使用。

1.2.2 不規則抗體的篩查 取患者EDTA二鉀鹽抗凝血標本4 mL，未抗凝標本4 mL，3000 r/min離心5 min后，采用鹽水介質（室溫、4 ℃、37 ℃）和微柱凝膠抗球蛋白法同時檢測參照文獻[1]，全自動分析系統檢測出的陽性結果再用Diana微柱凝膠抗球蛋白卡復查。

1.2.3 不規則抗體特異性鑒定

1.2.3.1 鹽水法和抗人球蛋白法 在11支試管內分別加入1至10號譜細胞及洗滌三次的2%～5%自身細胞懸液各1滴，各加入被檢者血清2滴，混勻，分別置室溫、4 ℃、37 ℃下離心觀察并記錄結果，后置37 ℃孵育1 h，用生理鹽水洗滌3次，倒盡末次洗滌的鹽水，吸干試管邊緣的水分，于試管內加入抗人球蛋白試劑2滴，3000 r/min離心15 s，觀察結果，有凝集者為陽性，無凝集者為陰性；同時用IgG抗D致敏的2%～5%的O型RhD陽性壓積紅細胞做陽性對照，AB血清2滴加2%～5%的O型RhD陽性壓積紅細胞做陰性對照。

1.2.3.2 微柱凝膠法 在微柱凝膠卡上標記被檢者姓名及譜細胞的編號、自身細胞，用微量加樣器分別加入低離子液稀釋的0.8%～1%的譜細胞懸液、自身細胞懸液各50 μL，后加被檢者血漿25 μL于微柱凝膠卡中，置37 ℃專用孵育器內孵育15 min，1100 r/min離心9 min，肉眼觀察結果。紅細胞均勻沉于管底者為陰性，懸浮于凝膠表面或凝膠中段者為陽性。根據實驗結果對照標準細胞譜確定抗體的特異性。對鑒定為特異性抗體者，采用相對應的抗體試劑檢測紅細胞抗原是否為陰性，以確認所檢抗體的準確性。

1.2.4 不規則抗體免疫球蛋白類別鑒定方法 采用巰基試劑（2-Me）區分IgG和IgM技術。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，檢驗采用配對計數資料的 字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3種方法對血型抗體特異性鑒定結果 64例不規則抗體陽性患者，鹽水法檢出特異性抗體2例，抗人球蛋白法檢出55例抗體，微柱凝膠法檢出62例抗體。抗人球蛋白法和微柱凝膠法兩者比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 不規則抗體特異性分布 64例不規則抗體陽性患者中Rh系統抗體24例，MNSs系統11例，Lewis系統9例，Diego系統2例。抗D 3例、抗Ec 11例、抗E 9例、抗M 7例、抗 Lea 8例，抗Mur、抗Dia各2例，抗c、抗N、抗Leb、抗s各1例，抗-E聯合抗-Mur 1例，未確認抗體特異性17例。

3 討論

不規則抗體分為IgM和IgG類抗體，IgM抗體是天然產生的，IgG抗體是通過妊娠免疫、注射、異型輸血等刺激產生的，其分子量小可通過胎盤引起新生兒溶血病及輸血不良反應。輸血前常規檢查不規則抗體并進行抗體特異性鑒定對保障安全輸血至關重要。目前用于抗體特異性鑒定的方法有鹽水法、凝聚胺法、抗人球蛋白法、微柱凝聚法等。鹽水法用于檢測IgM類抗體，在4 ℃反應最強，37 ℃減弱，為了避免冷凝集干擾分別置室溫、4 ℃、37 ℃三種溫度下檢測。本實驗中鹽水法檢出的2例抗M抗體，凝聚胺法、抗人球蛋白法、微柱凝膠法均為陰性。

凝聚胺法易受到冷凝集素、肝素的影響，不能檢出Kell血型系統的抗-K抗體，判讀結果時間短需在1 min之內看結果、易受振搖力度的影響，凝集用力振搖或放置時間稍長可能消失，對抗E抗體漏檢[2]，對低濃度抗體不能檢出[3]，抗人球蛋白法和微柱凝膠法無法確定抗體特異性的再用凝聚法復檢，本實驗中無一例凝聚胺法檢測陽性其他方法檢測陰性的患者，它適用于急診搶救患者的交叉配血。

抗人球蛋白法較為經典，技術要求高，操作時間長，繁瑣，需要洗滌細胞，易受人為因素的影響，此方法檢出陽性特異性抗體55例，有7例微柱凝膠法陽性患者抗人球蛋白法檢測為陰性，經檢驗兩者差異有統計學意義（P<0.05）。endprint

微柱凝膠法是血型血清學方法的一項新的免疫學檢測技術，通過微柱凝膠的微孔過濾作用和抗原抗體特異性反應作用，經低速離心后，利用微柱凝膠層析分子排阻原則將發生凝集反應的紅細胞阻滯于凝膠上層，呈陽性，而游離的單個紅細胞，則穿過微孔到達凝膠底部，呈陰性反應，廣泛用于血型鑒定，交叉配血試驗，不規則抗體篩查，直接抗人球蛋白試驗等，對自身免疫性溶血性貧血（AIHA）的診斷具有重要價值[4]。其靈敏度高于抗人球蛋白法[5-9]，特異性強，操作標準化，簡便，快捷，標本用量少，結果判讀清晰，可照相存檔，省去抗人球蛋白法洗細胞的麻煩，缺點就是成本高，對多發性骨髓瘤及巨球蛋白血癥患者由于血清中產生大量M蛋白包裹紅細胞，易于聚集呈緡錢樣改變，產生假凝集[10]，需用抗人球蛋白法檢測。細胞懸液濃度需嚴格控制在0.8%～1%，否則易出現假陰性或假陽性。此方法檢出特異性抗體62例，有2例抗Ec聯合抗體用抗人球蛋白法檢測為抗E，漏檢抗c。

64例不規則抗體特異性分布中Rh系統所占比例最高，Rh血型抗體主要通過輸血或妊娠免疫產生的免疫性IgG抗體，是引起免疫性溶血性輸血反應和新生兒溶血癥最常見的不規則抗體[11-13]，重要性僅次于ABO血型系統，本實驗中大多數為女性患者和有輸血史/妊娠史患者，接受免疫刺激的機會多，所產生的抗體比率高。如輸血科條件允許可做Rh系統分型，選分型相同的血液進行輸注，可避免產生Rh系統抗體。MNSs系統、Lewis系統的抗體多數是天然產生的IgM抗體，少數為IgG抗體。抗M、抗N 抗體僅在抗球蛋白試驗陽性或37 ℃時才有臨床意義，能引起新生兒溶血病。Diego系統中Dia的抗原頻率低，檢出的抗體少。抗-Dia亦能引起新生兒溶血病。Lewis系統中抗Lea所占比例最高8例，抗-Lewis抗體多數是IgM型，在37 ℃抗人球蛋白實驗中有反應，此反應比室溫時的反應弱。未確定特異性抗體占26.56%，其原因有：（1）自身抗體和同種抗體同時存在；（2）是幾種抗體聯合在一起無法辨別；（3）抗體減弱與譜細胞格局不符；（4）有低頻率抗原的可能；（5）自身抗體比如紅斑狼瘡、自身免疫性溶血性貧血引起的[14-15]。

綜上所述，對擬輸血和手術的患者常規進行血型不規則抗體篩選，對結果陽性者再用鹽水法、微柱凝膠法進行抗體特異性鑒定，未確定抗體特異性者用抗人球蛋白法和凝聚胺法復檢，有利于早期發現和確認具有臨床意義的抗體，以使抗體陽性的患者在術前盡早獲得相配合的血液，確保輸血安全。同時對有輸血史或妊娠史的孕婦做產前抗體篩查，檢出血型不規則抗體，降低新生兒溶血癥的發生率。

參考文獻

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[14] Zhu W Y， Li H X， Liang Y. Significance of prenatal joint detection of ABO antibody titers and irregular antibodies in pregnant women with type O blood[J]. Clin Exp Obstet Gynecol，2014，41（1）：28-31.

[15] Dajak S， Roje D， Ha?pl Z H， et al. The importance of antenatal prevention of RhD immunisation in the first pregnancy[J]. Blood Transfus，2014，13（2）：1-6.

（收稿日期：2014-05-13） （本文編輯：石亞飛）endprint

微柱凝膠法是血型血清學方法的一項新的免疫學檢測技術，通過微柱凝膠的微孔過濾作用和抗原抗體特異性反應作用，經低速離心后，利用微柱凝膠層析分子排阻原則將發生凝集反應的紅細胞阻滯于凝膠上層，呈陽性，而游離的單個紅細胞，則穿過微孔到達凝膠底部，呈陰性反應，廣泛用于血型鑒定，交叉配血試驗，不規則抗體篩查，直接抗人球蛋白試驗等，對自身免疫性溶血性貧血（AIHA）的診斷具有重要價值[4]。其靈敏度高于抗人球蛋白法[5-9]，特異性強，操作標準化，簡便，快捷，標本用量少，結果判讀清晰，可照相存檔，省去抗人球蛋白法洗細胞的麻煩，缺點就是成本高，對多發性骨髓瘤及巨球蛋白血癥患者由于血清中產生大量M蛋白包裹紅細胞，易于聚集呈緡錢樣改變，產生假凝集[10]，需用抗人球蛋白法檢測。細胞懸液濃度需嚴格控制在0.8%～1%，否則易出現假陰性或假陽性。此方法檢出特異性抗體62例，有2例抗Ec聯合抗體用抗人球蛋白法檢測為抗E，漏檢抗c。

64例不規則抗體特異性分布中Rh系統所占比例最高，Rh血型抗體主要通過輸血或妊娠免疫產生的免疫性IgG抗體，是引起免疫性溶血性輸血反應和新生兒溶血癥最常見的不規則抗體[11-13]，重要性僅次于ABO血型系統，本實驗中大多數為女性患者和有輸血史/妊娠史患者，接受免疫刺激的機會多，所產生的抗體比率高。如輸血科條件允許可做Rh系統分型，選分型相同的血液進行輸注，可避免產生Rh系統抗體。MNSs系統、Lewis系統的抗體多數是天然產生的IgM抗體，少數為IgG抗體。抗M、抗N 抗體僅在抗球蛋白試驗陽性或37 ℃時才有臨床意義，能引起新生兒溶血病。Diego系統中Dia的抗原頻率低，檢出的抗體少。抗-Dia亦能引起新生兒溶血病。Lewis系統中抗Lea所占比例最高8例，抗-Lewis抗體多數是IgM型，在37 ℃抗人球蛋白實驗中有反應，此反應比室溫時的反應弱。未確定特異性抗體占26.56%，其原因有：（1）自身抗體和同種抗體同時存在；（2）是幾種抗體聯合在一起無法辨別；（3）抗體減弱與譜細胞格局不符；（4）有低頻率抗原的可能；（5）自身抗體比如紅斑狼瘡、自身免疫性溶血性貧血引起的[14-15]。

綜上所述，對擬輸血和手術的患者常規進行血型不規則抗體篩選，對結果陽性者再用鹽水法、微柱凝膠法進行抗體特異性鑒定，未確定抗體特異性者用抗人球蛋白法和凝聚胺法復檢，有利于早期發現和確認具有臨床意義的抗體，以使抗體陽性的患者在術前盡早獲得相配合的血液，確保輸血安全。同時對有輸血史或妊娠史的孕婦做產前抗體篩查，檢出血型不規則抗體，降低新生兒溶血癥的發生率。

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（收稿日期：2014-05-13） （本文編輯：石亞飛）endprint

微柱凝膠法是血型血清學方法的一項新的免疫學檢測技術，通過微柱凝膠的微孔過濾作用和抗原抗體特異性反應作用，經低速離心后，利用微柱凝膠層析分子排阻原則將發生凝集反應的紅細胞阻滯于凝膠上層，呈陽性，而游離的單個紅細胞，則穿過微孔到達凝膠底部，呈陰性反應，廣泛用于血型鑒定，交叉配血試驗，不規則抗體篩查，直接抗人球蛋白試驗等，對自身免疫性溶血性貧血（AIHA）的診斷具有重要價值[4]。其靈敏度高于抗人球蛋白法[5-9]，特異性強，操作標準化，簡便，快捷，標本用量少，結果判讀清晰，可照相存檔，省去抗人球蛋白法洗細胞的麻煩，缺點就是成本高，對多發性骨髓瘤及巨球蛋白血癥患者由于血清中產生大量M蛋白包裹紅細胞，易于聚集呈緡錢樣改變，產生假凝集[10]，需用抗人球蛋白法檢測。細胞懸液濃度需嚴格控制在0.8%～1%，否則易出現假陰性或假陽性。此方法檢出特異性抗體62例，有2例抗Ec聯合抗體用抗人球蛋白法檢測為抗E，漏檢抗c。

64例不規則抗體特異性分布中Rh系統所占比例最高，Rh血型抗體主要通過輸血或妊娠免疫產生的免疫性IgG抗體，是引起免疫性溶血性輸血反應和新生兒溶血癥最常見的不規則抗體[11-13]，重要性僅次于ABO血型系統，本實驗中大多數為女性患者和有輸血史/妊娠史患者，接受免疫刺激的機會多，所產生的抗體比率高。如輸血科條件允許可做Rh系統分型，選分型相同的血液進行輸注，可避免產生Rh系統抗體。MNSs系統、Lewis系統的抗體多數是天然產生的IgM抗體，少數為IgG抗體。抗M、抗N 抗體僅在抗球蛋白試驗陽性或37 ℃時才有臨床意義，能引起新生兒溶血病。Diego系統中Dia的抗原頻率低，檢出的抗體少。抗-Dia亦能引起新生兒溶血病。Lewis系統中抗Lea所占比例最高8例，抗-Lewis抗體多數是IgM型，在37 ℃抗人球蛋白實驗中有反應，此反應比室溫時的反應弱。未確定特異性抗體占26.56%，其原因有：（1）自身抗體和同種抗體同時存在；（2）是幾種抗體聯合在一起無法辨別；（3）抗體減弱與譜細胞格局不符；（4）有低頻率抗原的可能；（5）自身抗體比如紅斑狼瘡、自身免疫性溶血性貧血引起的[14-15]。

綜上所述，對擬輸血和手術的患者常規進行血型不規則抗體篩選，對結果陽性者再用鹽水法、微柱凝膠法進行抗體特異性鑒定，未確定抗體特異性者用抗人球蛋白法和凝聚胺法復檢，有利于早期發現和確認具有臨床意義的抗體，以使抗體陽性的患者在術前盡早獲得相配合的血液，確保輸血安全。同時對有輸血史或妊娠史的孕婦做產前抗體篩查，檢出血型不規則抗體，降低新生兒溶血癥的發生率。

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[4] Zhou X L， Yan S， Li P， et al. Application of micro-column gel cards assay for direct Coombs test in diagnosis of autoimmune hemolytic anemia[J].Chinese Journal of Hematology，2012，33（1）：31-33.

[5]孔祥騫.柱凝膠技術在輸血前抗體篩檢中的應用分析及方法學探討[J].中國現代醫生，2012，50（28）：111-113.

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[7]袁曉華，楊春菊.兩種不規則抗體篩查試驗的應用比較[J].細胞與分子免疫學雜志，2014，30（3）：316-317.

[8] Petrusi?-Kafedzi? A， Ivankovi? Z， Ekinovi? S， et al. Changes in the structure and clinical significance of the positive results of pretransfusion testing during the switching from tube test agglutination to gel microcolumn technique[J]. Med Glas （Zenica），2010，7（2）：124-131.

[9]嚴達剛，陳應紅，董玉紅，等.2種方法對紅細胞同種抗體的檢測能力的比較[J].中國輸血雜志，2014，27（1）：32-34.

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（收稿日期：2014-05-13） （本文編輯：石亞飛）endprint