免疫性血小板減少癥患者協(xié)同刺激分子的表達及意義

任敏+單哲+許聯(lián)紅

【摘要】 目的：探討特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）患者外周血淋巴細胞CD28、CD80及CD86的表達及意義。方法：采用免疫熒光標記和流式細胞術檢測30例ITP患者和30例健康對照者外周血CD28細胞、CD80細胞和CD86細胞分別占淋巴細胞的比例及血小板表面相關抗體水平，并進行對比、分析。結果：與正常對照組相比，ITP患者外周血CD28細胞增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；CD80細胞增多，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；CD86細胞顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），此結果與ITP是否急慢性無關。治療前后患者的CD28、CD80及CD86的表達率比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。患者與正常對照組PAIgA、PAIgG和PAIgM的水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；CD80、CD86表達與PAIgG水平之間存在顯著的相關性，比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結論：ITP患者外周血淋巴細胞CD28、CD80及CD86表達均異常，可能與其發(fā)病相關。

【關鍵詞】 免疫性血小板減少癥； CD28； CD80； CD86

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是一類以血小板數(shù)量減少為主要特點的出血性疾病，其表現(xiàn)為血小板壽命縮短，骨髓象見骨髓巨核細胞數(shù)目增多，一般脾臟無明顯腫大[1]。目前的研究表明，該類疾病患者存在免疫反應異常，導致其體內(nèi)產(chǎn)生血小板抗體（PAIg），引起血小板被巨噬細胞破壞增加。而有研究顯示，T、B淋巴細胞的免疫異常與ITP的發(fā)病密切相關，包括其活化、增殖、凋亡異常等方面，而在這一過程中協(xié)同刺激分子（CD28、CD80、CD86）的作用顯得尤為重要[2-3]。為了探討ITP發(fā)病的免疫相關機制，筆者采用免疫熒光標記及流式細胞技術檢測ITP患者外周血淋巴細胞中CD28、CD80、CD86的表達，并檢測ITP患者血小板抗體（PAIgA、PAIgG和PAIgM）水平，分析其與協(xié)同刺激分子表達改變的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月-2014年6月間本院門診及住院的ITP患者30例，診斷均符合第3版《血液病診斷及療效標準》[1]。選擇30例近期無感染、肝炎、結核的健康志愿者作為正常對照組，ITP組年齡18～75歲，中位年齡46歲，其中男16例，女14例，急性18例，慢性18例，采集標本時血小板數(shù)為（2～45）×109/L，未行脾切除治療。正常對照組年齡18～70歲，中位年齡42歲，其中男15例，女15例，采集標本時血小板為正常，所有研究對象采血時均未接受血小板輸注。

1.2 材料及試劑 FACSCalibur型流式細胞儀為BD公司產(chǎn)品。單克隆抗體CD4-APC，CD28-PE，CD80-FITC，CD86-PE，CD19-APC及其陰性對照均購于美國BD Pharmingen公司。

1.3 方法

1.3.1 CD28、CD80、CD86的檢測 （1）標本采集：采集受檢者空腹靜脈血2 mL， EDTA-K2抗凝。（2）單克隆抗體標記：分別取100 μL抗凝血放入3支驗管和1支對照管，實驗管分別加20 mL CD28-PE、CD80-PE、CD86-PE，對照管加20 mL鼠抗人IgG1-PE，室溫避光孵育30 min，加入細胞裂解液2 mL混勻，靜置8 min，300 g離心5 min。（3）棄上清，加入PBS緩沖液，混勻200 g離心5 min。（4）棄上清，每管加入250 mL鞘液，重懸細胞，上流式細胞儀檢測。（5）協(xié)同刺激分子的檢測：用前向角散射和側(cè)向角散射散點圖區(qū)分細胞群體，用門圈出分析的淋巴細胞群體。每份標本檢測20 000個細胞。計算CD28、CD80及CD86陽性細胞比例。

1.3.2 血小板相關抗體（PAIg）檢測 采用酶聯(lián)免疫法測定PAIg，抽取受檢者靜脈血4 mL，EADT-Na2抗凝，分離血小板，按ELISA法試劑盒操作說明書進行PAIg檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

3 討論

有研究顯示，在ITP患者體內(nèi)可檢測到血小板的自身抗體，這些抗體能夠與血小板的表面抗原結合，與巨噬細胞Fc受體相互作用，進而導致巨噬細胞對血小板的清除，引起血小板的減少[4]。目前已有試驗證實，T淋巴細胞在ITP患者體內(nèi)的異常活化，導致了自身抗血小板抗體的產(chǎn)生，從而引起ITP發(fā)病[5]。

在T細胞的活化過程中，需要兩個信號進行刺激，一個是來自抗原遞呈細胞（APC）表面的MHC-Ag復合體，其通過T細胞上的TCR/CD3傳遞給T細胞的初始激活信號。另一個則是協(xié)同刺激信號，該類協(xié)同刺激因子是由APC和T細胞表面的黏附分子相互作用所提供的。目前研究所發(fā)現(xiàn)的最重要的協(xié)同刺激因子是CD80、CD86與CD28，CD80、CD86作為受體，廣泛存在于抗原遞呈細胞（APC）上，如B淋巴細胞、單核巨噬細胞，而CD28則是T淋巴細胞上的相應配體[6]。CD28屬于免疫球蛋白超家族成員，其定位于染色體2q33區(qū)[7-8]。它主要表達于T細胞和漿細胞表面。通過CD28/B7分子對T細胞的協(xié)同刺激作用可增強IL-2基因轉(zhuǎn)錄，促進IL-2合成[9]。另外，CD28分子所啟動的胞內(nèi)信號還可促進Bcl-XL表達從而保護T細胞免于凋亡[10]。趙艷霞等[11]發(fā)現(xiàn)，ITP患者外周血CD4+CD28+細胞表達下調(diào)，從而使T細胞易被誘導凋亡因素激活而凋亡。

根據(jù)McMillan R等[12]的研究報道，ITP發(fā)病時B細胞能夠產(chǎn)生抗血小板自身抗體，該抗體的產(chǎn)生受Th細胞及他們產(chǎn)生的細胞因子所控制，因此，在ITP的發(fā)病過程中存在Th1/Th2的平衡紊亂以及細胞因子的異常分泌，從而使B細胞出現(xiàn)活化異常進而產(chǎn)生抗血小板抗體，最終導致ITP的發(fā)病。有文獻[13]報道ITP患者存在T細胞亞群Th1/Th2失衡，而B細胞表面的CD80、CD86表達率明顯上升，從而提示兩者在ITP發(fā)病機制中起一定作用。endprint

筆者的研究結果顯示，ITP患者的外周血淋巴細胞CD28表達率明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示ITP患者T細胞活化存在異常，但這與潘建玲等[14]的報道并不一致。與正常對照組相比，ITP患者的外周血淋巴細胞CD80的表達率均偏高，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），究其原因，可能與試驗例數(shù)偏少有關，CD86的表達率明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這與相關文獻[15]報道也是相一致的，這表明CD28：CD80和CD28：CD86協(xié)同刺激通路可能參與ITP的發(fā)病。通過對CD80、CD86表達率與PAIgG的相關性分析證明了由于ITP患者的B細胞活化異常，導致過多的血小板自身抗體產(chǎn)生，其可游離于血液中，也能夠與血小板結合，因此與血小板結合的PAIg的檢測陽性率較高。此外，筆者還將治療前后ITP患者的協(xié)同刺激分子表達率加以比較，雖然經(jīng)過糖皮質(zhì)激素或丙種球蛋白治療，患者的血小板數(shù)量可以上升至正常，但治療前后的CD28、CD80及CD86的表達率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且通過隨訪筆者發(fā)現(xiàn)很多患者會出現(xiàn)病情反復，這是否提示目前的治療方法，如糖皮質(zhì)激素、免疫球蛋白清除部分血小板抗體，不能從本質(zhì)上阻斷血小板抗體的產(chǎn)生；是否會有相應的單克隆抗體藥物產(chǎn)生，能夠通過CD28、CD80與CD86的協(xié)同刺激途徑，抑制B淋巴細胞的活化，減少血小板自身抗體的產(chǎn)生，達到治療ITP的作用，這也已然成為ITP治療研究的新方向。

參考文獻

[1]張之南.血液病診斷及診療標準[M].第2版.北京：科學出版社，1998：2-5.

[2]常濤濤，郝國平.原發(fā)性ITP患兒外周血血小板相關抗體和淋巴細胞亞群的變化及臨床意義[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2013，10（9）：1-2.

[3]章圣輝，畢來喜，韓義香，等.CD28/CTLA-4：B7在特發(fā)性血小板減少性紫癜患者外周血淋巴細胞中的表達和意義[J].臨床血液學雜志，2010，23（2）：77-79.

[4] McMillan R.The pathogenesis of chronic immune （idiopathic） thrombocytopenic purpura[J].Seminars in hematology，2000，37（1）：5-9.

[5] Beardsley D S.Pathophysiology of immune thrombocytopenic purpura[J].Blood Rev，2002，16（1）：13-14.

[6]馬肖容，陳銀霞，張王剛，等.特發(fā)性血小板減少性紫癜患者外周血共刺激分子的表達與血小板抗體關系的臨床研究[J].中國實驗血液學雜志，2009，17（2）：483-486.

[7] Janeway C A Jr，Bottomly K.Signals and signs for lymphocyte responses[J].Cell，1994，76（2）：275-285.

[8] June C H，Bluestone J A.The B7 and CD28 receptor families[J].ImmunolToday，1994，15（7）：321-331.

[9] Sanchez Lockhart M，Mill E R J.Engagement of CD28 outside of the immunological synapse result sinup-egulation of IL22 mRNA stability but not IL-transcription[J].Immunol，2006，176（8）：4778-4784.

[10]馬進才.急性冠脈綜合征雙重抗血小板聯(lián)用質(zhì)子泵抑制劑150例臨床觀察[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2013，10（14）：32-33.

[11]楊繼紅.小紅細胞對血細胞分析儀血小板計數(shù)的影響[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2012，9（28）：70-71.

[12]McMillan R.Autoantibodies and autoantigens in chronic immune Thrombocytopenicurpura[J].Sem in Hematol，2000，37（3）：239-248.

[13]雷樹勇，陸愛權，陳海云，等.急性ITP患兒外周血CD4+CD25+ Tr細胞及其與IL-18的相關性研究[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2013，10（1）：41-43.

[14]潘建玲，關秀茹，馬學華，等.特發(fā)性血小板減少性紫癜患者協(xié)同刺激分子的表達[J].中國免疫學雜志，2007，8（20）：16-19.

[15]滕平，袁紅，高娟，等.單采血小板采集提速后對血小板質(zhì)量和獻血反應率的影響[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2012，9（32）：144-146.

（收稿日期：2014-07-09） （本文編輯：陳丹云）endprint

筆者的研究結果顯示，ITP患者的外周血淋巴細胞CD28表達率明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示ITP患者T細胞活化存在異常，但這與潘建玲等[14]的報道并不一致。與正常對照組相比，ITP患者的外周血淋巴細胞CD80的表達率均偏高，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），究其原因，可能與試驗例數(shù)偏少有關，CD86的表達率明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這與相關文獻[15]報道也是相一致的，這表明CD28：CD80和CD28：CD86協(xié)同刺激通路可能參與ITP的發(fā)病。通過對CD80、CD86表達率與PAIgG的相關性分析證明了由于ITP患者的B細胞活化異常，導致過多的血小板自身抗體產(chǎn)生，其可游離于血液中，也能夠與血小板結合，因此與血小板結合的PAIg的檢測陽性率較高。此外，筆者還將治療前后ITP患者的協(xié)同刺激分子表達率加以比較，雖然經(jīng)過糖皮質(zhì)激素或丙種球蛋白治療，患者的血小板數(shù)量可以上升至正常，但治療前后的CD28、CD80及CD86的表達率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且通過隨訪筆者發(fā)現(xiàn)很多患者會出現(xiàn)病情反復，這是否提示目前的治療方法，如糖皮質(zhì)激素、免疫球蛋白清除部分血小板抗體，不能從本質(zhì)上阻斷血小板抗體的產(chǎn)生；是否會有相應的單克隆抗體藥物產(chǎn)生，能夠通過CD28、CD80與CD86的協(xié)同刺激途徑，抑制B淋巴細胞的活化，減少血小板自身抗體的產(chǎn)生，達到治療ITP的作用，這也已然成為ITP治療研究的新方向。

參考文獻

[1]張之南.血液病診斷及診療標準[M].第2版.北京：科學出版社，1998：2-5.

[2]常濤濤，郝國平.原發(fā)性ITP患兒外周血血小板相關抗體和淋巴細胞亞群的變化及臨床意義[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2013，10（9）：1-2.

[3]章圣輝，畢來喜，韓義香，等.CD28/CTLA-4：B7在特發(fā)性血小板減少性紫癜患者外周血淋巴細胞中的表達和意義[J].臨床血液學雜志，2010，23（2）：77-79.

[4] McMillan R.The pathogenesis of chronic immune （idiopathic） thrombocytopenic purpura[J].Seminars in hematology，2000，37（1）：5-9.

[5] Beardsley D S.Pathophysiology of immune thrombocytopenic purpura[J].Blood Rev，2002，16（1）：13-14.

[6]馬肖容，陳銀霞，張王剛，等.特發(fā)性血小板減少性紫癜患者外周血共刺激分子的表達與血小板抗體關系的臨床研究[J].中國實驗血液學雜志，2009，17（2）：483-486.

[7] Janeway C A Jr，Bottomly K.Signals and signs for lymphocyte responses[J].Cell，1994，76（2）：275-285.

[8] June C H，Bluestone J A.The B7 and CD28 receptor families[J].ImmunolToday，1994，15（7）：321-331.

[9] Sanchez Lockhart M，Mill E R J.Engagement of CD28 outside of the immunological synapse result sinup-egulation of IL22 mRNA stability but not IL-transcription[J].Immunol，2006，176（8）：4778-4784.

[10]馬進才.急性冠脈綜合征雙重抗血小板聯(lián)用質(zhì)子泵抑制劑150例臨床觀察[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2013，10（14）：32-33.

[11]楊繼紅.小紅細胞對血細胞分析儀血小板計數(shù)的影響[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2012，9（28）：70-71.

[12]McMillan R.Autoantibodies and autoantigens in chronic immune Thrombocytopenicurpura[J].Sem in Hematol，2000，37（3）：239-248.

[13]雷樹勇，陸愛權，陳海云，等.急性ITP患兒外周血CD4+CD25+ Tr細胞及其與IL-18的相關性研究[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2013，10（1）：41-43.

[14]潘建玲，關秀茹，馬學華，等.特發(fā)性血小板減少性紫癜患者協(xié)同刺激分子的表達[J].中國免疫學雜志，2007，8（20）：16-19.

[15]滕平，袁紅，高娟，等.單采血小板采集提速后對血小板質(zhì)量和獻血反應率的影響[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2012，9（32）：144-146.

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筆者的研究結果顯示，ITP患者的外周血淋巴細胞CD28表達率明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示ITP患者T細胞活化存在異常，但這與潘建玲等[14]的報道并不一致。與正常對照組相比，ITP患者的外周血淋巴細胞CD80的表達率均偏高，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），究其原因，可能與試驗例數(shù)偏少有關，CD86的表達率明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這與相關文獻[15]報道也是相一致的，這表明CD28：CD80和CD28：CD86協(xié)同刺激通路可能參與ITP的發(fā)病。通過對CD80、CD86表達率與PAIgG的相關性分析證明了由于ITP患者的B細胞活化異常，導致過多的血小板自身抗體產(chǎn)生，其可游離于血液中，也能夠與血小板結合，因此與血小板結合的PAIg的檢測陽性率較高。此外，筆者還將治療前后ITP患者的協(xié)同刺激分子表達率加以比較，雖然經(jīng)過糖皮質(zhì)激素或丙種球蛋白治療，患者的血小板數(shù)量可以上升至正常，但治療前后的CD28、CD80及CD86的表達率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且通過隨訪筆者發(fā)現(xiàn)很多患者會出現(xiàn)病情反復，這是否提示目前的治療方法，如糖皮質(zhì)激素、免疫球蛋白清除部分血小板抗體，不能從本質(zhì)上阻斷血小板抗體的產(chǎn)生；是否會有相應的單克隆抗體藥物產(chǎn)生，能夠通過CD28、CD80與CD86的協(xié)同刺激途徑，抑制B淋巴細胞的活化，減少血小板自身抗體的產(chǎn)生，達到治療ITP的作用，這也已然成為ITP治療研究的新方向。

參考文獻

[1]張之南.血液病診斷及診療標準[M].第2版.北京：科學出版社，1998：2-5.

[2]常濤濤，郝國平.原發(fā)性ITP患兒外周血血小板相關抗體和淋巴細胞亞群的變化及臨床意義[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2013，10（9）：1-2.

[3]章圣輝，畢來喜，韓義香，等.CD28/CTLA-4：B7在特發(fā)性血小板減少性紫癜患者外周血淋巴細胞中的表達和意義[J].臨床血液學雜志，2010，23（2）：77-79.

[4] McMillan R.The pathogenesis of chronic immune （idiopathic） thrombocytopenic purpura[J].Seminars in hematology，2000，37（1）：5-9.

[5] Beardsley D S.Pathophysiology of immune thrombocytopenic purpura[J].Blood Rev，2002，16（1）：13-14.

[6]馬肖容，陳銀霞，張王剛，等.特發(fā)性血小板減少性紫癜患者外周血共刺激分子的表達與血小板抗體關系的臨床研究[J].中國實驗血液學雜志，2009，17（2）：483-486.

[7] Janeway C A Jr，Bottomly K.Signals and signs for lymphocyte responses[J].Cell，1994，76（2）：275-285.

[8] June C H，Bluestone J A.The B7 and CD28 receptor families[J].ImmunolToday，1994，15（7）：321-331.

[9] Sanchez Lockhart M，Mill E R J.Engagement of CD28 outside of the immunological synapse result sinup-egulation of IL22 mRNA stability but not IL-transcription[J].Immunol，2006，176（8）：4778-4784.

[10]馬進才.急性冠脈綜合征雙重抗血小板聯(lián)用質(zhì)子泵抑制劑150例臨床觀察[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2013，10（14）：32-33.

[11]楊繼紅.小紅細胞對血細胞分析儀血小板計數(shù)的影響[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2012，9（28）：70-71.

[12]McMillan R.Autoantibodies and autoantigens in chronic immune Thrombocytopenicurpura[J].Sem in Hematol，2000，37（3）：239-248.

[13]雷樹勇，陸愛權，陳海云，等.急性ITP患兒外周血CD4+CD25+ Tr細胞及其與IL-18的相關性研究[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2013，10（1）：41-43.

[14]潘建玲，關秀茹，馬學華，等.特發(fā)性血小板減少性紫癜患者協(xié)同刺激分子的表達[J].中國免疫學雜志，2007，8（20）：16-19.

[15]滕平，袁紅，高娟，等.單采血小板采集提速后對血小板質(zhì)量和獻血反應率的影響[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2012，9（32）：144-146.

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