空間生命科學(xué)共焦顯微圖像采集系統(tǒng)*

鞠洪偉，張 濤，鄭偉波，蔡 萍，劉方武

（1.中國科學(xué)院 上海技術(shù)物理研究所，上海 200083;2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

0 引言

空間生命科學(xué)實驗中在軌實驗數(shù)據(jù)的獲取、樣品的實時監(jiān)測與分析主要依靠生命科學(xué)儀器完成，而空間生命科學(xué)實驗用顯微鏡作為實驗過程記錄和結(jié)果分析的可視化工具，是空間生命科學(xué)儀器的重要組成部分。目前，對生物樣品的顯微觀測手段主要包括普通光學(xué)顯微、熒光顯微以及共焦顯微等。共焦顯微技術(shù)作為現(xiàn)代生命科學(xué)研究重要的檢測手段，通過共焦光路和掃描技術(shù)實現(xiàn)對探測點的高分辨率掃描成像［1，2］，配合軸向步進(jìn)，可以完成樣品的光切，得到三維圖像。近年來，NASA成功研制共焦顯微模塊，并組合到光學(xué)顯微模塊（light microscopy module，LMM）中，用于在軌的微重力液體、物理和生物實驗中的樣品顯微觀察。

隨著生命科學(xué)的飛速發(fā)展，生命科學(xué)實驗涉及的范圍越來越廣，而空間生命科學(xué)實驗中需要顯微觀察的生物樣品可能具有活性和移動性等特點，所以，空間生命科學(xué)實驗中針對活體目標(biāo)進(jìn)行觀察的需求日益緊迫，而傳統(tǒng)的點式掃描共焦顯微鏡基于逐點掃描探測成像原理，往往在512×512圖像分辨率下，掃描成像時間在s級，很難在圖像幀頻上達(dá)到活體觀察要求。在逐點掃描方式中，每點的駐留時間很短，如要完成1 frame/s（512×512）的成像速度，激發(fā)光在每點的駐留時間只有4μs，要想在這么短的時間內(nèi)激發(fā)出探測器能夠探測到的熒光，就必須加大激發(fā)光的功率，這樣就會對樣品造成一定損傷。而應(yīng)用掃描盤進(jìn)行全視場同時掃描的共焦顯微系統(tǒng)同時激發(fā)約1000個針孔，掃描幀頻可以達(dá)到幾百赫茲，配合面陣弱光探測成像裝置，圖像幀頻可以達(dá)到活體觀察需求。由于掃描盤瞬間通過多個針孔激發(fā)樣品，所以，在每點的等效駐留時間要長得多，這就可以降低激發(fā)光的功率，繼而降低系統(tǒng)的光毒性和光漂白效應(yīng)，所以，基于多針孔掃描盤的快速共焦顯微系統(tǒng)更適用于空間生命科學(xué)實驗中長時間的活體目標(biāo)觀察。目前各種熒光共焦顯微鏡中應(yīng)用較為成熟弱光探測器包括:光電倍增管（PMT）、雪崩二極管（APD）;多元面陣器件包括:高靈敏制冷CCD、微通道板或像增強CCD（ICCD）、電子倍增CCD（EMCCD）等。

1 共焦顯微原理與系統(tǒng)方案

基于針孔式掃描盤建立的快速共焦顯微系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)如圖1所示，激發(fā)光源發(fā)出的光經(jīng)過準(zhǔn)直、擴(kuò)束之后，透過分光鏡，依次經(jīng)過快速掃描盤和顯微物鏡。物鏡匯聚的激發(fā)光照射在樣品上，樣品受激發(fā)射的熒光按照原光路返回，當(dāng)發(fā)射熒光經(jīng)過快速掃描系統(tǒng)時，被濾去物方非焦面發(fā)射的雜散光。分光鏡反射的熒光經(jīng)過透鏡匯聚后被CCD接收，獲取樣品共焦顯微圖像。通過控制樣品在Z軸上步進(jìn)，進(jìn)而改變樣品的光切位置，可以獲得樣品不同切面的圖像，最終通過一定的圖像處理技術(shù)可以獲得樣品的三維圖像。

圖1 快速掃描共焦顯微系統(tǒng)結(jié)構(gòu)Fig 1 Structure of fast scanning confocal microscopy system

2 EMCCD相機(jī)結(jié)構(gòu)與組件內(nèi)容

圖1所建立的共焦顯微系統(tǒng)以針孔盤作為掃描部件，它以多點針孔同時對視場進(jìn)行掃描，因此，圖像采集器件宜采用面陣器件，綜合探測靈敏度、圖像輸出幀頻、空間應(yīng)用等角度考慮，系統(tǒng)采用EMCCD作為圖像采集器件。它與傳統(tǒng)CCD器件在感光、存儲等結(jié)構(gòu)上并無差異，之所以在探測靈敏度、信噪比上表現(xiàn)出色，是因為在其讀出寄存器之后又多出了一串增益寄存器，增益寄存器的單個倍增單元如圖2所示。與普通的三相CCD轉(zhuǎn)移電極相比，EMCCD將Ф2分為Ф2和Фdc，一般Фdc接2 V左右的直流偏置，Ф2接高壓（40 V左右）轉(zhuǎn)移時鐘，由于Ф2與Фdc之間存在高壓差，當(dāng)信號電荷從Ф1向Ф2轉(zhuǎn)移時，強電場會使電荷加速并與其他電荷碰撞產(chǎn)生新的電子，電子被Ф2勢井收集實現(xiàn)1次信號倍增。單個倍增單元的倍增率是隨機(jī)的，一般在1% ～1.5%范圍內(nèi)，雖然單個倍增單元增益很低，但當(dāng)多個倍增單元級聯(lián)時，總增益由式（1）確定

其中，g為單個倍增單元的倍增率，n為倍增單元數(shù)，當(dāng)n取500時，總增益可能達(dá)2000倍以上。

圖2 單個倍增單元結(jié)構(gòu)Fig 2 Structure of single multiplier unit

系統(tǒng)采用英國E2V公司的CCD97器件作為成像探測器［3］，CCD97是減薄背照式幀轉(zhuǎn)移型 EMCCD，具有512×512有效像素，像素尺寸為16 μm×16 μm，它同時具有普通模式與倍增模式成像方式，相應(yīng)具有兩路讀出放大器。倍增模式下制冷到-40℃，可達(dá)30 photons/pixel/s（積分時間為0.1 s）的探測能力，滿足弱光探測需求，同時在11 MHz像素時鐘下，噪聲低于1電子/pixel，量子效率達(dá)90%以上，滿足高幀頻需求。

整套系統(tǒng)的電子學(xué)設(shè)計圍繞EMCCD的驅(qū)動需求展開，按功能主要劃分為3個模塊:邏輯驅(qū)動模塊、功率驅(qū)動模塊和上位機(jī)圖像采集模塊，系統(tǒng)功能框圖如圖3所示。

圖3 EMCCD相機(jī)功能結(jié)構(gòu)Fig 3 Functional structure of EMCCD camera

2.1 邏輯驅(qū)動模塊

邏輯驅(qū)動模塊主要完成EMCCD幀轉(zhuǎn)移、行轉(zhuǎn)移、行輸出等邏輯信號輸出、AD時序控制輸出、SRAM時序控制輸出以及圖像數(shù)據(jù)串行輸出等功能，邏輯模塊核心器件采用ACTEL公司的APA300器件，它基于Flash技術(shù)，無需配置芯片，功耗低，對固件錯誤有較好的免疫作用，可以抵御一些高能粒子的沖擊，最大優(yōu)勢在于在特殊環(huán)境下可以穩(wěn)定可靠地工作，適合航天領(lǐng)域的應(yīng)用。圖像信號采集部分用AD9824，它是ADI公司一種專用于CCD信號處理的AD器件，它包含14位精度最高采樣率為30MSPS的A/D轉(zhuǎn)換器，芯片內(nèi)部集成了相關(guān)雙采樣電路、像素增益放大器、可編程增益放大器。邏輯驅(qū)動模塊的硬件程序各子模塊的調(diào)用關(guān)系如圖4所示。

圖4 硬件程序結(jié)構(gòu)Fig 4 Structure of hardware program

2.2 功率驅(qū)動模塊

CCD97的驅(qū)動除了對信號相位要求嚴(yán)格外，還要求信號電平和上升時間多樣化，針對不同信號的電平和上升時間需求，功率驅(qū)動模塊采用4種電路方案，包括偏置電平電路、圖像轉(zhuǎn)移信號電路（ФIS，ФR）及高壓時鐘電路。

由于CCD97直流偏置所需電流不大，所以，偏置電平電路采用電阻分壓與運放跟隨實現(xiàn)。圖像轉(zhuǎn)移信號上升時間較短，需要較大的驅(qū)動電流，圖像幀轉(zhuǎn)移、行轉(zhuǎn)移、行輸出信號功率驅(qū)動電路以EL7457作為核心器件。它是Elantec公司推出的四通道CMOS專用驅(qū)動器，最高工作頻率可達(dá)40 MHz，最大驅(qū)動電流2A，具有低輸出阻抗、外圍電路簡單、方便電源管理等優(yōu)點，非常適用于多電平復(fù)雜時序的CCD器件驅(qū)動設(shè)計。

圖像轉(zhuǎn)移信號功率驅(qū)動電路如圖5所示［4］，由于ФI，Φs，ФR信號的上升時間要求不同，實際調(diào)試電路時選擇合適的電阻器（R1～R5）使得信號上升時間盡量滿足器件需求，保證輸出的圖像質(zhì)量較高。

圖5 圖像轉(zhuǎn)移信號驅(qū)動電路Fig 5 Image transfer signal driving circuit

高壓時鐘是實現(xiàn)倍增模式成像的關(guān)鍵信號，它的電平?jīng)Q定了倍增增益，并最終影響器件在低照度下的成像效果。由于高壓時鐘的電平較高，一般在40 V左右，驅(qū)動電流100 mA左右，使用集成元件很難實現(xiàn)，所以，高壓時鐘電路采用分立元件實現(xiàn)，電路如圖6所示［5］。

圖中電路的靜態(tài)偏置由二極管 D1，D2，D3，D4，D5，D6以及電阻器R1，R3，R4所組成的分壓網(wǎng)絡(luò)提供。Q1的柵源極靜態(tài)電壓約為-1 V，Q2的柵源極靜態(tài)電壓約為1 V。當(dāng)FPGA驅(qū)動脈沖為低時，U1和U2的輸出為5V，Q1的柵源極電壓為-1 V，Q2的柵源極電壓為6 V，此時，Q1關(guān)斷，Q2導(dǎo)通，Φ2HV被拉低到0V;當(dāng)FPGA脈沖為高時，U1和U2的輸出為0V，Q1的Vgs為-6 V，Q2的Vgs為1 V，此時Q2關(guān)斷，Q1導(dǎo)通，Ф2HV被拉高到電源電壓Vhigh。Ф2HV的輸出相位與FPGA輸出邏輯信號相同，高低電平與高壓電源一致。

圖6 高壓時鐘驅(qū)動電路Fig 6 High-voltage clock driving circuit

2.3 上位機(jī)軟件

上位機(jī)控制軟件主要負(fù)責(zé)指令編碼、指令下傳以及圖像數(shù)據(jù)接收、圖像數(shù)據(jù)存儲、圖像顯示等工作。

上位機(jī)軟件開發(fā)環(huán)境為VC++6.0，通過調(diào)用操作系統(tǒng)自帶的MScomm控件完成指令下傳與數(shù)據(jù)接收。通過點擊界面上的“打開串口”按鈕建立相機(jī)與上位機(jī)間的通信，點擊“打開相機(jī)”按鈕完成相機(jī)參數(shù)與開機(jī)指令下傳，開啟圖像數(shù)據(jù)接收線程，待正確接收數(shù)據(jù)包頭并完成一整幅圖像數(shù)據(jù)接收后，顯示接收圖像并保存圖像數(shù)據(jù)。

3 圖像采集驗證與分析

驗證實驗鏡頭采用MV2514機(jī)器視覺鏡頭，該鏡頭放大倍率為0.23倍，焦距為25 mm，F(xiàn)數(shù)可小至1.4，可見光波段內(nèi)透過率約90%，機(jī)械接口為標(biāo)準(zhǔn)C接口，可兼容2/3 in CCD，最小工作距130mm。實驗中采用6mm特寫環(huán)在0.01 lx微光、100 ms積分時間、2 dB增益條件下使用普通模式與倍增模式分別對同一目標(biāo)成像，圖像如圖7所示。

圖7 普通模式與倍增模式圖片F(xiàn)ig 7 Normal and multiplication mode image

從獲得的暗背景條件下的圖像數(shù)據(jù)可計算出噪聲平均灰度值與方差，分別選擇普通模式下與倍增模式下目標(biāo)圖像的最亮點作為信號，取多幅圖像數(shù)據(jù)的亮點信號并計算平均值，可以獲得普通模式下與倍增模式下的信噪比，列于表1。

表1 實驗對比數(shù)據(jù)Tab 1 Contrast data of experiment

從表中可以得出:相比普通模式，在44 V倍增時鐘電壓驅(qū)動下，倍增模式輸出圖像的信號有7倍提升，信噪比也有8倍提升，證明CCD97在微弱光條件下，使用倍增模式可以獲得較高質(zhì)量的目標(biāo)圖像。

根據(jù)圖1搭建共焦顯微系統(tǒng)，使用40倍物鏡對擬南芥進(jìn)行熒光顯微成像。普通顯微模式與共焦顯微模式分別對樣品所成圖像如圖8所示。

EMCCD相機(jī)倍增模式與普通模式使用相同AD增益，積分時間分別取100，50 ms。從圖8可以看出:EMCCD在倍增模式下可以獲得比較清晰的擬南芥葉肉共焦顯微熒光圖像。相比普通顯微模式，由于對樣品進(jìn)行光切的原因，使得系統(tǒng)在共焦顯微模式下可以清晰的分辨出擬南芥葉肉葉綠體。

圖8 擬南芥葉綠素?zé)晒鈭D像Fig 8 Fluorescence image of chlorophyll

4 結(jié)論

通過對空間生命科學(xué)實驗中共焦顯微的原理分析，提出一套適用于活體目標(biāo)觀察、對樣品低損傷的共焦顯微方案。根據(jù)目標(biāo)的掃描方案和獲取目標(biāo)發(fā)射光的能量大小提出基于CCD97的弱光圖像采集系統(tǒng)，將系統(tǒng)分成3個功能模塊分別實現(xiàn)并最終完成原理樣機(jī)研制。在普通模式與倍增模式下分別獲取目標(biāo)圖像，從圖像效果可以看出:該成像系統(tǒng)性能較高，對弱光目標(biāo)有很好的成像效果，且該系統(tǒng)具有體積小、可靠性高、適合空間應(yīng)用等特性。

［1］Gu Min.共焦顯微術(shù)的三維成像原理［M］.王桂英，陳 偵，楊莉松，譯.北京:新時代出版社，2000:14-51.

［2］Colin J R Sheppard.Aberrations in high aperture conventional and confocal imaging systems［J］.Applied Optics，1988，27（22）:4782-4786.

［3］E2V Technologies inc.CCD97—00 back illuminated 2-phase IMO series electron multiplying CCD sensor［EB/OL］.［2004—05—11］.http://www.e2vtechnologies.com.

［4］孫 靜，張保平，曹睿學(xué).基于EMCCD的驅(qū)動電路設(shè)計［J］.現(xiàn)代電子技術(shù)，2011，34（4）:150-154.

［5］Texas Instruments.TC285SPD—B0 1004 ×1002 pixel impactron CCD image sensor［EB/OL］.［2004—05—31］.http://www.ti.com.