急性胰腺炎大鼠血清蛋白質組學分析

余開煥 任俊 黃運濤 陳辰 宋湧

·論著·

急性胰腺炎大鼠血清蛋白質組學分析

余開煥 任俊 黃運濤 陳辰 宋湧

目的分析急性水腫型胰腺炎(AEP)和急性壞死型胰腺炎(ANP)大鼠血清蛋白質表達的差異，尋找判斷AP病情的血清指標。方法采用4%或5%牛磺膽酸鈉逆行注入膽胰管法分別制備AEP和ANP大鼠模型。應用血清蛋白質譜弱陽離子交換芯片(WCX2)，采用表面增強激光解析離子化飛行時間質譜(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)技術分析AEP和ANP大鼠血清蛋白質譜的差異。結果AEP和ANP大鼠血清蛋白質在質荷比為1000～50 000分子量之間有38個蛋白質差異表達(P<0.05)，其中AEP大鼠血清中分子量為9500和9700的兩種蛋白質表達明顯高于ANP大鼠。結論用SELDI-TOF-MS技術能檢測出AEP與ANP大鼠血清蛋白質的差異表達。分子量9500和9700蛋白質的表達下降可能是AEP向ANP轉化的征兆。

胰腺炎； 蛋白質組學； 血清； 質譜法

臨床上將急性胰腺炎(AP)分為輕癥急性胰腺炎(MAP)和重癥急性胰腺炎(SAP)。MAP在病理學上表現為急性水腫性胰腺炎(AEP)，而SAP則多表現為急性壞死性胰腺炎(ANP)。本研究制備大鼠的AEP及ANP模型，應用表面增強激光解析離子化飛行時間質譜(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)技術分析AEP與ANP大鼠血清蛋白質譜表達的差異，尋找判斷AEP進展為ANP的血清標志物。

材料和方法

一、動物模型制作及分組

雄性Wistar大鼠30只，體重250 g左右，購自武漢大學人民醫院動物實驗中心。按數字表法隨機分為對照組、AEP組和ANP組，每組10只。參照Aho造模方法[1]，采用4%或5%牛磺膽酸鈉(Sigma公司)以1 ml/kg體重的劑量逆行注入膽胰管分別制備AEP和ANP模型。對照組只接受剖腹術，胰管不注入任何液體。12 h后從大鼠心臟取血，離心取血清，部分血清用于淀粉酶的檢測，其余置-80℃冰箱待用；取大鼠胰腺，常規病理檢查，并依據Shmidt標準[2]評分。

二、血清蛋白譜檢測

1．血清樣本準備： 4℃下融解冰凍血清，每個樣品取10 μl，加入20 μl U9緩沖液(9 mol/L尿素，2%CHAPS，50 mmol/L Tris-HCL，pH9.0)，4℃下400 r/min振蕩30 min，然后向30 μl稀釋樣品中加入50 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.0)370 μl混勻。

2．芯片預處理、上樣和洗脫：弱陽離子交換芯片(WCX2)購于Ciphergen公司。將WCX2芯片裝入生物芯片處理器，每孔加入200 μl 醋酸鈉緩沖液，400 r/min振蕩5 min，甩掉緩沖液，重復2次。芯片處理器每孔加入100 μl 樣品，4℃ 400 r/min振蕩1 h。甩出樣品，每孔加入200 μl醋酸鈉緩沖液，室溫下400 r/min振蕩5 min，重復2次。每孔加入200 μl HPLC水，立刻甩出，重復1次。取出芯片，待干后每個加樣孔上加SPA(50% CAN+0.5% TFA)0.5 μl，重復1次，待干后上機測定。

3．芯片的檢測和結果分析：先設定儀器主要參數，激光強度175，檢測靈敏度6，優化分子量范圍1000～20 000，最高為50 000。收集樣品點數為100次。數據收集分子量范圍1000～50 000，先用信噪比(s/n)>5和>2各過濾一次。篩出的質荷比峰在10%以上的樣本中同時存在，且同一質荷比峰在不同樣本中的偏差<0.3%，以去除原始數據中的噪聲。經上述數據處理后，用Ciphergen proteinchip3.1自動采集數據，計算機根據所獲得的原始數據快速精確地繪制出蛋白質質譜圖，縱坐標為波峰強度，即蛋白質相對含量，橫坐標為質荷比(M/Z)，即蛋白質相對分子量。然后用Biomarker Wizard軟件進行數據比較和Mann-WhitneyU檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、模型的判定

對照組、AEP組和ANP組大鼠血清淀粉酶水平分別為(882±106)、(2174±320)、(4757±556)U/L，各組間差異均有統計學意義(P<0.05)。AEP組大鼠胰腺組織的水腫、腺泡壞死、出血和脂肪壞死、炎癥細胞浸潤4項病理評分分別為3.5±0.3、0、0.5±0.2、3.4±0.6；ANP組分別為3.8±0.5、3.7±0.2、3.6±0.6、3.6±0.5，其中ANP組的腺泡壞死、出血和脂肪壞死的分值明顯高于AEP組(P<0.05)。表明模型制作成功。

二、AEP與ANP大鼠血清差異表達的蛋白

經SELDI-TOF-MS技術分析比較AEP組和ANP組的血清蛋白質，一共檢測到138個蛋白質峰，其中38個蛋白質含量差異有統計學意義(P<0.05)，AEP大鼠9500和9700的蛋白質表達明顯高于ANP大鼠(圖1)。

圖1 ANP組(上)和AEP組(下)血清蛋白質譜

臨床上常采用Ranson評分[3]、APACHEⅡ標準[4]、Balthazar CT[5]評分判斷AP病情的嚴重程度，但均有一定的局限性。許多學者正在尋找可靠、快捷的血清學指標，其中C-反應蛋白有一定價值，但其血清濃度在發病48 h后才達到高峰[6-8]，因此尋找更加簡捷、有效的血清學指標來判定SAP仍然十分必要。

AP在其發病過程中，體內蛋白質也會發生相應的改變。SELDI-TOF-MS技術作為較新的蛋白質組學研究方法，具有快速、高通量、高敏感性、重復性好的優點。將它與正常對照或某種疾病的圖譜，甚至基因庫中的圖譜進行對照，即能發現和捕獲新的特異性相關蛋白質[9]。在臨床上，MAP多表現為AEP， SAP多表現為ANP。因此，通過比較AEP與ANP狀態下血清蛋白質表達差異，可能為該技術臨床應用于判定MAP和SAP提供實驗基礎和理論依據。本研究制備AEP和ANP大鼠模型，經SELDI-TOF-MS檢測分析，AEP和ANP大鼠血清中有38個表達差異的蛋白質，其中9500和9700分子量的蛋白質表達差異最為明顯，說明這兩者表達下降可能是AEP向ANP轉化的征兆，同時兩者相連，可能是同一蛋白質因如磷酸化和脫磷酸化[10-11]而導致結構變化表現的不同表達狀態。為此，我們下一步將對臨床上MAP和SAP患者的血清予以驗證，進一步分析這兩種蛋白的臨床實用價值。

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2010-11-02)

(本文編輯：呂芳萍)

Serumproteomicanalysisofacutepancreatitisinrats

YUKai-huan,RENJun,HUANGYun-tao,CHENChen,SONGYong.

DepartmentofGeneralSurgery,People′sHospital,WuhanUniversity,Wuhan430060,China

RENJun,Email:renjun0414@163.com

ObjectiveTo investigate the difference of the protein expression in serum of rats with acute edematous pancreatitis (AEP) and acute necrotizing pancreatitis (ANP), and to investigate serum marker for acute pancreatitis severity.MethodsThe model of AEP and ANP was induced by retrograde injection of 4% or 5% sodium taurocholate into the biliopancreatic duct. Weak cation exchange (WCX2) and surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (SELDI TOF MS) was used to investigate the difference of the protein expression in serum of rats with AEP and ANP.ResultsThirty-eight spectral peak clusters which had significantly different signal intensities between AEP and ANP sera at mass charge ratio between 1000-50 000(P<0.05) were detected. The peak clusters at 9500 and 9700 in the sera of AEP were higher than that in ANP rats.ConclusionsSerum analysis with SELDI-TOF MS can detect the difference of the protein expression in rats with AEP and ANP. The decreased expression of the protein of molecular weight of 9500 and 9700 may be a signal of AEP transition into ANP.

Pancreatitis; Proteomics; Serum; Mass spectrometry

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.008

湖北省自然科學基金(131349)

430060 湖北武漢，武漢大學人民醫院普外科

任俊，Email:renjun0414@163.com