西蘭花種子中蘿卜硫素的提取工藝研究

（微生物藥物國家工程研究中心，河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，河北石家莊050015）

十字花科蔬菜（如花椰菜、西蘭花、羽衣甘藍(lán)及菠菜等）富含多種芥子苷（glucosinnolates），當(dāng)其被咀嚼時(shí)，硫代葡萄糖苷（一種芥子苷）會(huì)被硫代葡萄糖苷酶水解，產(chǎn)生蘿卜硫素（sulforaphane）。

蘿卜硫素分子量為177.3，分子式為C6H11S2NO。蘿卜硫素通過調(diào)控致癌物的代謝而起作用［1］，它能通過作用于人體內(nèi)的“phase two enzymes”激發(fā)人體的自我抗癌機(jī)制，中和體內(nèi)某些致癌化學(xué)物質(zhì)，造成癌細(xì)胞阻滯，抑制其繁殖并誘導(dǎo)其死亡，可有效預(yù)防胰腺癌、肺癌、直腸癌、乳腺癌及前列腺癌等多種癌癥的發(fā)生［2－4］。蘿卜硫素是目前發(fā)現(xiàn)的蔬菜中抗癌效果最好、效力最強(qiáng)的天然活性物質(zhì)，作為藥品或食品的功效成分，具有很高的研究價(jià)值和廣闊的市場前景。

作者在此以西蘭花種子為原料，提取其中的蘿卜硫素，并對提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

西蘭花種子，杭州勿忘農(nóng)種子公司。

去離子水，自制；無水硫酸鈉，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

高速萬能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；高速勻漿機(jī)，上海龍屹儀器儀表有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；高效液相色譜儀（996檢測器，515泵），Waters公司；Loborata 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，Heidolph 公司；中壓層析系統(tǒng)（C－601泵，C－615控制器，C－616收集器，C－635檢測器），瑞士Buchi公司。

1.2 方法

提取：將20g西蘭花種子用粉碎機(jī)打碎，磨成粉末狀后等量分成2份。一份加入預(yù)凍的正己烷，用高速勻漿機(jī)混合均勻后脫脂，過濾，加入100mL 去離子水；另一份不脫脂直接加入100mL去離子水。2份均用0.5mol·L－1鹽酸溶液調(diào)pH 值至4.0，25 ℃恒溫水浴下磁力攪拌12h，用2倍體積乙酸乙酯萃取3遍，加入過量無水硫酸鈉置于冰庫脫水4h，過濾，濾液在35 ℃減壓濃縮，所得浸膏稱重，計(jì)算蘿卜硫素粗品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（提取率）。比較脫脂和未脫脂的西蘭花種子中蘿卜硫素的提取率。

分別考察水解pH 值、水解時(shí)間、萃取溶劑對脫脂西蘭花種子中蘿卜硫素提取率的影響，確定最優(yōu)的提取工藝。

精制：將蘿卜硫素粗品用丙酮溶解，進(jìn)行硅膠柱層析。用乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，分管收集后進(jìn)行檢測，將純度超過95%的洗脫液合并，真空濃縮至干，得蘿卜硫素精制品。

色譜條件：Hypersil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，10μm）；流動(dòng)相為甲醇－水（30∶70，體積比）；流速1.0mL·min－1；檢測波長254nm；進(jìn)樣量10μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫脂對提取率的影響（圖1）

圖1 脫脂對提取率的影響Fig.1 Effect of degreasing on extraction rate

由圖1可見，脫脂后的提取率遠(yuǎn)高于未脫脂的提取率。這是因?yàn)椋疵撝魈m花種子含有大量的油脂，阻礙了硫代葡萄糖苷與硫代葡萄糖苷酶的接觸，無法使蘿卜硫素完全釋放；而且由于混合液中含有大量的水溶性蛋白和多糖，沉淀物質(zhì)較多，溶液黏度很大，導(dǎo)致在萃取和過濾時(shí)一部分蘿卜硫素?zé)o法被乙酸乙酯洗脫，提取率較低。

2.2 水解pH 值對提取率的影響（圖2）

圖2 水解pH 值對提取率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis pH value on extraction rate

由圖2可見，水解pH 值為5.0時(shí)，提取率最高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脫脂西蘭花種子水溶液用鹽酸溶液調(diào)pH值至5.0后于室溫水解12h的提取率最高；但高效液相色譜檢測發(fā)現(xiàn)水解pH 值為5.0時(shí)的提取物中含有異硫氰酸鹽雜質(zhì)，而水解pH 值為4.0時(shí)的提取物相對純度提高很大，且濾液中的蛋白質(zhì)能夠有效聚集沉淀，可通過反復(fù)萃取除去。因此，選擇水解pH 值為4.0較為適宜。

2.3 水解時(shí)間對提取率的影響（圖3）

圖3 水解時(shí)間對提取率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on extraction rate

由圖3可知，提取率隨著水解時(shí)間的延長先升高后降低，在水解時(shí)間為12h時(shí)，達(dá)到最高。這是因?yàn)椋}卜硫素由于外部環(huán)境的變化逐漸不穩(wěn)定，在水解時(shí)間為12h時(shí)達(dá)到了生成與降解的平衡。因此，為了防止蘿卜硫素降解，應(yīng)及時(shí)終止水解反應(yīng)并進(jìn)行乙酸乙酯萃取，故選擇水解時(shí)間為12h較為適宜。

2.4 萃取溶劑對提取率的影響（表1）

表1 萃取溶劑對提取率的影響Tab.1 Effect of extraction solvent on extraction rate

由表1可知：以二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮為萃取溶劑時(shí)，蘿卜硫素的純度變化不大，而提取率依次降低，其中以二氯甲烷為萃取溶劑時(shí)的提取率最高，且溶殘率低；以正己烷為萃取溶劑時(shí)，不能有效提取蘿卜硫素。考慮到二氯甲烷的毒性較大，選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑較為適宜。

2.5 蘿卜硫素粗品的精制

蘿卜硫素粗品呈油狀，經(jīng)丙酮溶解后裝入硅膠柱，用乙酸乙酯分離提純后，有效去除雜質(zhì)，純度由86%提高到95%以上，提取率為3.5%。

3 結(jié)論

以西蘭花種子為原料提取蘿卜硫素的最優(yōu)工藝為：將粉碎好的西蘭花種子用正己烷脫脂、過濾，調(diào)水溶液pH 值至4.0，水解12h，用乙酸乙酯萃取，并經(jīng)硅膠柱層析提純，提取率為3.5%，產(chǎn)品純度超過95%。該方法簡單易行，提取率穩(wěn)定，可為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

［1］HU R，XU C J，SHEN G X，et al.Gene expression profiles induced by cancer chemopreventive isothiocyanate sulforaphane in the liver of C57BL／6Jmice and C57BL／6J／Nrf2（－／－）mice［J］.Cancer Letters，2006，243（2）：170－192.

［2］KANT A K，SCHATZKIN A，GRAUBARD B I，et al.A prospective study of diet quality and mortality in women［J］.Journal of A－merican Medical Association，2000，283（16）：2109－2115.

［3］PERRY C L，McGUIRE M T，NEUMARK－SZTAINER D，et al.Adolescent vegetarians：How well do their dietary patterns meet the healthy people 2010objectives［J］.Archives of Pediatrics ＆Adolescent Medicine，2002，156（5）：431－437.

［4］SMITH－WARNER S A，SPIEGELMAN D，YAUN S S，et al.Intake of fruits and vegetables and risk of breast cancer：A pooled analysis of cohort studies［J］.JAMA，2001，285（6）：769－776.