基于二階變換的高效液相色譜法測定食品中丙烯酰胺

徐立恒 王 笑 葉艷芬

(中國計(jì)量學(xué)院質(zhì)量與安全工程學(xué)院，杭州 310018)

基于二階變換的高效液相色譜法測定食品中丙烯酰胺

徐立恒 王 笑 葉艷芬

(中國計(jì)量學(xué)院質(zhì)量與安全工程學(xué)院，杭州 310018)

針對(duì)方便面等面粉類食品中丙烯酰胺的測定，建立了基于二階變換的高效液相色譜測定方法。該方法將二階變換處理技術(shù)應(yīng)用于HPLC的數(shù)據(jù)分析和處理，可以使食品樣品HPLC圖中丙烯酰胺色譜峰得到顯著的銳化，大大提高定量分析的準(zhǔn)確度和靈敏度。該方法測定丙烯酰胺的線性范圍寬泛，定量檢測限(LOQ)<10 μg/L，加標(biāo)回收率為88.3%～91.0%，明顯優(yōu)于不經(jīng)二階變換處理的HPLC法。采用該方法對(duì)市售方便面樣品進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺含量在10～300 μg/kg范圍內(nèi)，其含量小于薄脆餅干等常見的面粉類食品。

二階變換 HPLC 信號(hào)處理 食品 丙烯酰胺

丙烯酰胺是食品在熱加工過程中部分氨基酸和還原糖反應(yīng)形成的產(chǎn)物，廣泛存在于熱加工的淀粉類食品中，比如油炸薯類制品、咖啡和谷物早餐[1-3]。由于丙烯酰胺具有潛在的神經(jīng)毒性、遺傳毒性和致癌性(IIA類)[4-5]，對(duì)人們的健康存在巨大威脅，自從2002年首次在食品中被發(fā)現(xiàn)以來引起了人們的高度重視。在我國人民的飲食結(jié)構(gòu)中，小麥粉類食品包括煎、炸、烤等熱加工工藝生產(chǎn)的面粉類食品占有重要的位置，建立小麥粉類食品中丙烯酰胺的檢測方法、監(jiān)測丙烯酰胺的濃度水平是評(píng)估丙烯酰胺攝入量和健康風(fēng)險(xiǎn)、指導(dǎo)食品加工工藝的必然要求。

高效液相色譜(HPLC)是復(fù)雜體系分離分析的良好手段，在食品中丙烯酰胺的測定中得到了廣泛的應(yīng)用[6-8]。但是對(duì)于丙烯酰胺含量很低的食品樣品，普通的液相色譜很難滿足測定要求，通常需要采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜甚至質(zhì)譜/質(zhì)譜來進(jìn)行分析，對(duì)儀器條件提出了更高的要求，很難在日常監(jiān)測中應(yīng)用。

二階變換是一種簡便的信號(hào)處理技術(shù)，可以有效的放大信號(hào)、增強(qiáng)峰的識(shí)別能力，并減少基線漂移等的影響，近年來在光譜信號(hào)處理以及定量定性分析中得到了廣泛的應(yīng)用[9-11]。將二階變換信號(hào)處理技術(shù)應(yīng)用于HPLC的數(shù)據(jù)分析和處理，可以使低濃度組分的較小色譜峰得到顯著銳化，有效提高檢測方法的靈敏度，有希望解決低含量組分的測定問題。本文采用二階變換對(duì)HPLC的信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，建立適用于低含量食品中丙烯酰胺的高效液相色譜測定技術(shù)，并應(yīng)用該方法對(duì)市售方便面樣品丙烯酰胺含量進(jìn)行了測定。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；LG10-2.4A高速離心機(jī)：北京京立離心機(jī)有限公司；VisiprepTMDL固相萃取裝置：美國Supelco公司；HC-C18固相萃取小柱：上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(≥99%)、甲醇(色譜純)、正己烷(色譜純)：百靈威科技有限公司；其余試劑均為分析純。CarrezⅠ試劑：15.00 g三水合亞鐵氰化鉀(K4Fe(CN)6·3H2O)溶解于水中并稀釋至100 mL；CarrezⅡ試劑：30.00 g七水合硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)溶解于水中并稀釋至100 mL。餅干樣品為市場隨機(jī)采集，均在保質(zhì)期內(nèi)，按要求條件貯藏。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent公司ZORBAX SB-C18色譜柱；流動(dòng)相：10%甲醇-水；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：15 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm。

1.3 樣品預(yù)處理

將方便面樣品粉碎后準(zhǔn)確稱取樣品5 g于100 mL燒杯中，加入30 mL水，磁力攪拌20 min后轉(zhuǎn)入離心管中，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min；移取上層清液于分液漏斗中，加入正己烷萃取3次以除去油脂；移取除脂后的樣品液10mL于離心管中，分別加入CarrezⅠ、CarrezⅡ試劑各5 mL，混勻靜置20 min后，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min以除去蛋白質(zhì)；上清液經(jīng)活化的HC-C18固相萃取柱純化，流出液用于HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 二階變換信號(hào)處理應(yīng)用于HPLC法定量分析

二階變換是一種簡便的信號(hào)處理方法，采用二階變換對(duì)色譜流出曲線進(jìn)行處理，可得：

式中：x為保留時(shí)間，y為信號(hào)強(qiáng)度。例如，圖1a所示為丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品在HPLC上進(jìn)行分析得到的流出曲線，保留時(shí)間4.32 min的色譜峰即為丙烯酰胺的色譜峰。將HPLC流出曲線進(jìn)行二階求導(dǎo)變換，結(jié)果如圖1b所示，流出曲線中丙烯酰胺的色譜峰變成了一個(gè)尖銳的倒峰。與原色譜峰相比，二階變換以后的色譜峰峰高得到了顯著的放大，并且峰寬明顯變小，色譜峰變得更加尖銳、易于識(shí)別和分析。

HPLC法通常通過峰高或峰面積進(jìn)行定量分析。

圖1 丙烯酰胺標(biāo)樣的HPLC流出曲線(a)和經(jīng)二階變換處理的流出曲線(b)

在二階變換以后的色譜圖中，我們選用色譜峰峰高的絕對(duì)值作為丙烯酰胺定量分析的依據(jù)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。如圖2所示，在丙烯酰胺質(zhì)量濃度為10～500 μg/L范圍內(nèi)，絕對(duì)峰高與丙烯酰胺的濃度呈良好的線性關(guān)系，其線性相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999 8，可見二階變換色譜圖的絕對(duì)峰高完全可以作為定量分析的特征值，可以滿足定量分析的要求。采用該方法對(duì)丙烯酰胺進(jìn)行定量分析時(shí)線性范圍寬泛，其定量限(LOQ)可低至10 μg/L，與文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC-MS/MS方法相當(dāng)[6]。

圖2 二階變換處理色譜圖的絕對(duì)峰高與丙烯酰胺濃度關(guān)系

2.2 食品樣品色譜圖的二階變換

食品中丙烯酰胺的含量隨食品種類、加工方式等的變化而不同，歐洲食品安全局對(duì)10 000多份樣品檢測結(jié)果表明，丙烯酰胺的含量在幾十到幾千μg/kg范圍內(nèi)[12]。對(duì)于丙烯酰胺含量較低的樣品，直接HPLC法很難對(duì)其進(jìn)行定量分析。

圖3 某方便面樣品的HPLC流出曲線(a)和二階變換流出曲線(b)

圖3a為一方便面樣品的HPLC色譜圖，由圖3a可見，丙烯酰胺的色譜峰不明顯，峰高較低且峰寬較大，與相近色譜峰分離不完全，而且色譜曲線的基線漂移明顯，這些都為色譜峰的確認(rèn)和峰面積的計(jì)算帶來嚴(yán)重干擾，因此無法準(zhǔn)確的進(jìn)行定量分析。對(duì)該樣品的色譜圖進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)變換處理，結(jié)果如圖3b所示，在保留時(shí)間4.32 min的色譜二階導(dǎo)數(shù)峰變得非常尖銳，與相鄰峰分離良好，經(jīng)與加標(biāo)樣品相對(duì)比可以確認(rèn)為丙烯酰胺的特征信號(hào)。因此，將二階變換信號(hào)處理技術(shù)HPLC法相結(jié)合測定食品中的丙烯酰胺，可以大大提高定量分析的準(zhǔn)確性和靈敏度。

2.3 基于二階變換的HPLC法測定方便面中的丙烯酰胺

試驗(yàn)采用基于二階變換的HPLC法對(duì)市售方便面樣品的丙烯酰胺含量進(jìn)行測定，首先考察該方法的回收率和精密度，以衡量測定方法可靠性。加標(biāo)回收試驗(yàn)的結(jié)果如表1所示，可以發(fā)現(xiàn)基于二階變換的HPLC法加標(biāo)回收率在88.3%～91.0%之間，與不經(jīng)二階變換數(shù)據(jù)處理的經(jīng)典HPLC法計(jì)算結(jié)果相對(duì)比，回收率普遍顯著提高。在同一試驗(yàn)條件下同一方便面樣品進(jìn)行多次重復(fù)測定(n=8)，得到基于二階變換的HPLC法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.8%。該方法回收率和精密度良好，能滿足測定的需要。

表1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)超市銷售的方便面隨機(jī)抽取27個(gè)樣品，按照基于二階變換的HPLC法測定丙烯酰胺含量，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次(圖4)。除3個(gè)樣品未檢出以外，其余方便面樣品均含有丙烯酰胺，含量基本在10～300 μg/kg范圍內(nèi)，其中11個(gè)樣品的丙烯酰胺含量小于50 μg/kg，大于150 μg/kg的樣品有4個(gè)。與歐洲食品安全局的測定結(jié)果相對(duì)比[12]，方便面中丙烯酰胺的含量低于薄脆餅干和烘脆面包中丙烯酰胺的含量，與軟面包的含量相當(dāng)。盡管方便面的加工溫度較高，但其比較低的糖含量可能減少了加工過程丙烯酰胺的形成。

圖4 方便面樣品的丙烯酰胺含量

3 結(jié)論

本研究將二階變換數(shù)據(jù)處理技術(shù)應(yīng)用于高效液相色譜分析法，建立了一種食品中丙烯酰胺的測定方法。二階變換處理可以使食品樣品HPLC圖中丙烯酰胺色譜峰得到顯著銳化，大大提高定量分析的準(zhǔn)確度和靈敏度?；诙A變換的HPLC法測定丙烯酰胺的線性范圍寬泛，LOQ低至10 μg/L，加標(biāo)回收率為88.3%～91.0%，明顯優(yōu)于不經(jīng)二階變換處理的HPLC法。該方法對(duì)儀器條件要求不高，數(shù)據(jù)處理簡便，適用于復(fù)雜體系中低濃度組分的監(jiān)測分析。采用該方法對(duì)市售方便面樣品進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺含量為10～300 μg/kg，其含量小于薄脆餅干等常見的小麥粉類食品。

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Determination of Acrylamide in Foods by HPLC Based on 2-Order Transformation

Xu Liheng Wang Xiao Ye Yanfen
(College of Quality & Safety Engineering China Jiliang University, Hangzhou 310018)

To aim to the determination of the acrylamide content in foods, a determination method based on 2nd-derivative HPLC chromatogram was established in this paper. It was found that in the 2nd-derivative HPLC chromatogram of food, the peak of acrylamide was sharp and separated with neighboring peaks. The limit of quantification (LOQ) of the 2-order transformation-HPLC method for acrylamide was <10 μg/L, the standard addition recoveries was in a range of 88.3%～91.0%, the accuracy and sensitivity were superior to that of HPLC method. The instant noodle samples purchased from market were determined by this method, and the acrylamide contents in instant noodles were about 10～300 μg/kg, lower than crackers and bread crisp.

2-order transformation, HPLC, signal process, acrylamide, food

TS207.3,O657.7

A

1003-0174(2014)06-0108-04

國家質(zhì)檢總局質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201210016)

2013-06-19

徐立恒，女，1976年出生，副教授，有機(jī)污染物檢測與食品安全