利用整體染色與透明技術觀察棉花胚囊方法

李建欣，代西梅，張佳佳，張永山

（1.鄭州大學 離子束生物工程省重點實驗室，湖南 鄭州 450052；2.中國農業科學院棉花研究所，河南 鄭州 455000）

棉花是我國一種重要的經濟作物，由于雜交育種的需要，對它的胚胎學曾進行過許多的研究工作。有關胚囊方面，國內外都有過一些報道［1-4］。從60年代初開始，對棉花受精作用的形態學，曾進行一系列的研究，推進了對受精過程的微觀現象的了解，其中以光學顯微結構觀察為主，也有部分超微結構的研究報道，采用石蠟切片的掃描電鏡觀察技術雖然可以觀察到胚囊的形態解剖結構，但是這種方法操作繁瑣，對實驗操作要求較高［5］。

激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）可以對活的或固定的細胞及組織進行無損傷的系列光學切片，得到其各層面的信息。這種功能也被形象地稱為“顯微CT”。此外，利用激光掃描共聚焦顯微鏡還可以對樣品材料進行連續掃描，通過電腦處理從而獲得其三維立體結構，對其樣品內各細胞的空間分布有更清晰的認識［6-8］。利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察水稻等植物的胚囊結構、形成及發育過程等方面的研究已有一些報道［9-12］。

但目前尚未見到利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察棉花胚囊結構的報道。因為棉花的胚珠較大，熒光染色觀察比較困難。本研究利用激光掃描共聚焦顯微鏡對棉花胚囊結構進行觀察，把非同一焦平面的圖像用連續掃描技術合成到一張圖像中。該方法制片簡單，方便操作，獲得了清晰的圖片及大量資料，為棉花胚囊結構的研究提供資料。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料是普通棉花品種，在開花前和授粉后分別取棉花的胚珠于FAA溶液中固定48h。

1.2 方法

（1）取胚囊：將已在FAA溶液中固定的棉花胚珠放入70%酒精與濃鹽酸的比例為3∶1的溶液中清洗3～5min，然后放在解剖鏡下將內外珠被剝掉，取出胚囊（這一步非常關鍵，需要一個熟練的過程，否則很容易在剝離內外珠被時弄破胚囊）在42℃水浴鍋中處理2.5h。

（2）復水：棉花胚囊經50%、30%、15%梯度酒精再到蒸餾水中，每級20min。

（3）水解：棉花胚囊在1mol／L NaOH 下水解8 h，蒸餾水徹底洗凈。

（4）襯染：加入1%的曙紅Y染色8h，吸去染色液，用蒸餾水清洗，換液數次至水中無浮色。

（5）緩沖液：加入pH＝5的檸檬酸-磷酸緩沖液處理8h。

（6）熒光染色：用5mg／L的熒光染料DAPI水溶液，在25℃暗室中染色24h。

（7）脫水：棉花胚囊從15%酒精中依次轉入30%、50%、70%、80%、95%、100%濃度梯度的酒精中各脫水20min，在100%酒精中再脫水3次，每次2h，最后1次12h。

（8）透明處理：棉花胚囊從100%酒精轉入水楊酸甲酯和無水酒精的等量混合液中約1h后，轉入水楊酸甲酯中，2次，每次3h，最后1次15h以上，經過透明處理的材料仍可保存于水楊酸甲酯中。

（9）制片觀察：將透明棉花胚囊置于滴有丁香油的凹形載玻片上，蓋上蓋玻片，在Leica SP2激光掃描共聚焦顯微鏡上用488nm激光激發觀察并攝像。

2 結果分析

2.1 成熟的胚囊、極核和卵細胞

激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到的棉花胚囊內的細胞形態見圖1。棉花成熟胚囊內珠孔端由2個助細胞、1個卵細胞和1個中央細胞共同構成雌性生殖單位（見圖中1）。在受精前，其中的1個助細胞退化，在成熟胚囊珠孔端，能見到1個助細胞、1個卵細胞和1個中央細胞（見圖中2）。中央細胞為1個高度液泡化的細胞，2個極核緊靠在一起，各有1個較大的核仁（見圖中3）。

圖1 激光共聚焦觀察棉花胚囊內的細胞形態

2.2 精核與卵核的融合

開花后花粉粒在柱頭上萌發，形成花粉管。花粉管形成后，進入胚囊，花粉管在退化助細胞的位置釋放出2個精子以及其他一些內含物。2個精核分別進入極核與卵細胞（見圖1中4）。進入卵細胞的精核慢慢移動到卵核的位置，然后精核的內容物慢慢進入卵細胞核，隨后在卵核內出現1個雄性核仁，然后雌性核仁與雄性核仁融合。至此，卵細胞與精子的融合完成而形成1個合子。

2.3 精核與極核的融合

精核與極核的融合過程類似于精核與卵核的融后過程。在觀察過程中發現，大部分精核是與1個極核融合后再與另1個極核發生融合的，偶爾可見到精核與次生核的融合。在開花后，可觀察到精核首先與1個極核的核膜接觸，進行核膜的融合（見圖1中5））；隨后精核的染色質向極核內分散；再后在極核內出現1個小的雄性核仁，雄性核仁會慢慢變大；最后增大至與極核的核仁差不多大小。1個精核與極核完成融合，形成初生胚乳核。精子與極核融合后很快進行分裂，行成初生胚乳核（見圖1中6）。

3 討論

棉花胚囊的觀察有很重要的實際價值，例如棉花中一些不育的胚珠稱為“籽屑”。籽屑對于紡織工業是個不利的因素。如果棉花中籽屑比例過高，便嚴重地影響紡紗質量。籽屑大致可以分為三類：（1）胚珠中不形成胚囊；（2）胚珠中有正常的胚囊，但沒有受精；（3）胚珠中受精了，但是胚胎發育受到了抑制。因此，從胚囊的觀察圖片上可區別出受精的和不受精的籽屑。棉花的胚胎發育還有很多畸形的現象，其影響了棉纖維的正常發育。有時，由于某種原因，導致一部分正在發育的胚胎敗育，致使棉纖維發育不良，降低纖維的質量，即所謂不成熟籽（或癟籽）的劣纖維。研究籽屑的成因和引起胚胎敗育的原因，采取人為措施，減少籽屑的產生及克服胚胎敗育，對于提高棉纖維的質量具有重要的意義［13］。

棉花胚囊經熒光染色及透明處理后，通過LSCM可清晰地觀察到胚囊內各細胞結構。細胞核及核仁經激光激發后可以顯示較強的熒光，通過LSCM的激光掃描系統可以清晰地觀察到胚囊內各細胞的結構及空間分布情況。由于棉花胚囊在成熟期較大，在觀察時發現胚囊內各細胞不一定在同一個光學切面上，此時可利用LSCM系列掃描功能進行逐層掃描。LSCM的這種功能可以使我們更準確地觀察組織內不同層面的結構，并免去石蠟切片、超薄切片等繁瑣的制片工作。系列掃描圖像經計算機三維重建后，可得到樣品的三維重建結構，三維重建后的圖像可沿X、Y、Z軸進行任意角度的旋轉，可從不同的角度觀察樣品內的結構及空間關系［14］。利用LSCM的這種連續掃描及重建功能同樣也可以清晰地觀察到棉花成熟胚囊內及雙受精過程中各細胞結構及其空間分布關系。

研究棉花成熟胚囊的結構，對胚囊結構各部分的超微結構，如細胞核的核膜、核仁中的核仁絲、液泡膜、液泡中的內含物以及胚囊壁內突等的觀察，幾乎全部用石蠟切片掃描電鏡的技術，但是材料的立體感不強，制片方法復雜，限制了研究者快速制片觀察以及更大范圍的應用。

利用LSCM觀察胚囊的關鍵問題是胚囊的剝離以及之后的水解和熒光染色的時間。由于棉花胚珠相對較大，所以在進行染色之前要在解剖鏡下把胚珠的內外珠被剝掉，只剩胚囊，對一個胚囊進行整體染色就比較容易，而在之后的水解階段由于棉花的細胞壁會阻礙熒光染料的進入，所以用NaOH處理的時間要合適，時間既不能太久否則會使細胞變形，時間也不能太短否則熒光染料不容易進入胚囊。熒光染料DAPI作用時間也需要合適，否則會看不清或者胚囊全部染色而導致無法清晰地觀察到細胞［15］。雖然此法不能像在透射電鏡下分辨細胞中的一些小細胞器，而且胚囊的超微結構觀察與前人的結果相似，但它的整體感強，制片方法簡便。而這種快捷的方法有著更深遠的價值。不僅可以應用在觀察棉花不育過程中染色體等的變化和棉纖維的發育，還可以用來觀察棉花胚囊內細胞骨架和Ca2＋ 的變化和分布［16］。所以接下來的研究工作是利用此種技術在棉花細胞學的層面上對棉花進行更深入的研究。

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