基于RNA-Seq的油茶種子油脂合成過程磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)的基因分析

江 南 ， 譚曉風(fēng) ， 張 琳

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410004；2.湖南工業(yè)大學(xué) 包裝與材料工程學(xué)院，湖南 株洲 412008）

磷脂酰肌醇（phosphatidyldinositol，PI）信號(hào)系統(tǒng)廣泛存在于生物體中，是與生物體內(nèi)Ca2+子信號(hào)途徑密切相關(guān)的一個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，既能夠影響基因表達(dá)，又參與細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境變化的響應(yīng)[1]。所有生物都需要對(duì)它們賴以生存的外界環(huán)境中各種環(huán)境因子做出響應(yīng)而適應(yīng)環(huán)境得以生存，當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，胞外信號(hào)需要通過第二信使系統(tǒng)將信號(hào)傳遞到胞內(nèi)，從而引起細(xì)胞的相應(yīng)生理生化反應(yīng)，達(dá)到調(diào)節(jié)生物體的生理功能適應(yīng)環(huán)境生存的目的[2]。磷脂酰肌醇及其各種衍生物具有相應(yīng)的信號(hào)傳遞功能[1]。目前磷脂酰肌醇及其相關(guān)衍生物在動(dòng)物及人體中的機(jī)能已有較為深入詳細(xì)的研究，對(duì)動(dòng)物磷脂酰信號(hào)傳遞途徑（PI途徑）已經(jīng)建立了一個(gè)較為完整的模型。研究表明，動(dòng)物細(xì)胞中的PI途徑對(duì)細(xì)胞間信號(hào)運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄調(diào)控細(xì)胞功能、離子通道開閉和能量代謝都具有重要的作用[3-4]。植物中PI途徑的研究近年來也取得了一些進(jìn)展，有研究表明，植物PI途徑與許多植物生理反應(yīng)關(guān)聯(lián)，例如滲透壓調(diào)節(jié)和植物防御反應(yīng)[5-6]，Perera和Fallon等重力刺激玉米實(shí)驗(yàn)[7-8]和紅光處理小麥黃化苗原生質(zhì)體實(shí)驗(yàn)[9]，證明了植物中三磷酸肌醇（IP3）信號(hào)被關(guān)聯(lián)到植物體中多個(gè)發(fā)育和生理途徑中。植物PI途徑中相關(guān)的基因PIS（磷脂酰肌醇合成酶基因）、PI4K（磷脂酰肌醇-4-激酶基因）、PIPK （二磷脂酰肌醇激酶基因）、PLC（磷脂酶 C 基因）、PLD（磷脂酶 D 基因）和5PTase（多磷酸肌醇-5-磷酸酶基因）等已經(jīng)被分離出來并進(jìn)行了功能的研究[6，10-11]。

油茶（Camellia oleifera）是世界四大木本油料樹種之一，適應(yīng)性廣，耐干旱、耐霜凍、耐貧瘠土壤。其成熟種子所含油脂——茶油是一種優(yōu)質(zhì)保健的食用油，其色純味香，富含油酸和亞油酸，不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)85%～90%。茶油的營養(yǎng)價(jià)值、保健價(jià)值可與目前風(fēng)糜歐美的橄欖油相媲美，是名副其實(shí)的綠色食用植物油。油茶遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，基因組龐大，近年來我國科研工作者對(duì)油茶分子研究主要集中在油脂合成過程基因調(diào)控方面，而油茶對(duì)環(huán)境因素響應(yīng)的分子機(jī)理研究甚少，油茶PI途徑的研究的未見報(bào)道。作者所在實(shí)驗(yàn)室對(duì)油茶信號(hào)傳導(dǎo)和逆境脅迫應(yīng)答進(jìn)行了初步研究，主要以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的油茶cDNA文庫和EST文庫為材料，從油茶近成熟種子中分離克隆了油茶鈣調(diào)素基因 （Calm）、油茶親環(huán)素基因 （Cyc）、油茶酪氨酸蛋白磷酸酶基因（PTPase）、油茶熱激蛋白質(zhì)基因（HSP）和油茶水通道蛋白質(zhì)基因（Aquaporin）等相關(guān)的基因[12-13]。同時(shí)在油茶種子的轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)，油茶種子油脂合成過程存在PI信號(hào)系統(tǒng)。作者在油茶種子轉(zhuǎn)錄組和不同時(shí)期表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，對(duì)油茶種子PI信號(hào)系統(tǒng)關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)分析，以期為相關(guān)基因的分離克隆、油茶品種的遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

國家審定油茶品種‘華碩’的膨大期果實(shí)和同年油脂合成高峰期果實(shí)，采自中南林業(yè)科技大學(xué)油茶種質(zhì)資源圃；果實(shí)采摘后需立即剝?nèi)》N仁，錫箔紙包好放入液氮保存，回實(shí)驗(yàn)室后種仁置于-80℃超低溫冰箱中保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油茶種仁總RNA提取及質(zhì)量檢測(cè) 在液氮中研磨‘華碩’果實(shí)膨大期和油脂合成高峰期種仁至均勻粉末，用Invitrogen公司總RNA提取試劑盒分別提取不同時(shí)期種仁總RNA。電泳檢測(cè)RNA的完整性，核酸/蛋白質(zhì)定量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度；取完整性好（28S∶18S 大致為 2∶1）、OD260/280值在1.9至2.2之間，樣品質(zhì)量濃度≥200 ng/μL的RNA樣品，-80℃保存?zhèn)溆脺y(cè)序。

1.2.2 油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫構(gòu)建 分別取以上兩個(gè)時(shí)期RNA等比例混合至總量為1 mg左右的混合樣品，干冰保存送至華大基因公司采用Illumina技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，組裝軟件SOAP denovo處理后獲得非冗余Unigene序列，構(gòu)建了油茶種子油脂合成調(diào)控過程中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。以Nr、SwissProt、KEGG和 COG等數(shù)據(jù)庫為參考，完成油茶種子轉(zhuǎn)錄組Unigene序列基因注釋，取evalue＜0.000 01的 Unigene視為已知基因[14]。

1.2.3 油茶種子表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫構(gòu)建 將上述兩個(gè)不同時(shí)期的RNA樣品各1mg左右分別用干冰保存，送至深圳華大基因公司采用Solexa技術(shù)進(jìn)行數(shù)字化表達(dá)譜測(cè)序。構(gòu)建油茶種子不同時(shí)期的表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，并以已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為參考，對(duì)整理和去雜后的表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫Unigene序列進(jìn)行基因注釋。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 從華大基因公司下載油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和表達(dá)譜測(cè)序數(shù)據(jù)，按轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中Pathway顯著富集對(duì)數(shù)據(jù)庫中的Unigenes按基因功能進(jìn)行分類，綜合分析油茶種子油脂形成過程中各代謝通路關(guān)鍵酶基因的調(diào)控位點(diǎn)、不同時(shí)期的表達(dá)差異，并推測(cè)其在油茶種子發(fā)育過程中的功能及與油茶油脂合成的關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 油茶種子油脂合成過程中轉(zhuǎn)錄組和不同時(shí)期表達(dá)譜的基本信息

油茶果實(shí)膨大期和油脂合成高峰期RNA混合樣品進(jìn)行Illumina雙末端測(cè)序（PE）及數(shù)據(jù)處理后最終獲得了69 798個(gè)非冗余Unigene片段。將油茶種子轉(zhuǎn)錄組非冗余Unigene序列比對(duì)到Swissport、Kegg、COG、Gene Ontology（GO）等數(shù)據(jù)庫，共有18 714條Unigene獲得基因注釋，歸并為124個(gè)代謝途徑，其中涉及PI號(hào)系統(tǒng)的Unigenes序列共212條，占全部注釋基因的1.13%。采用Solexa單端測(cè)序（SE），分別獲得油茶果實(shí)膨大期和油脂合成高峰期表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，對(duì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行整理和去雜后，得到高質(zhì)量測(cè)序標(biāo)簽（Clean Tags）；大部分?jǐn)?shù)據(jù)能夠通過前期構(gòu)建的油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫得到注釋。為了方便分析兩個(gè)時(shí)期基因表達(dá)差異，表達(dá)譜中Unigene的表達(dá)量取標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)量TPM（Transcript Per Million clean tags）值，可直接用于比較不同樣品間的相應(yīng)基因表達(dá)差異[15]，取FDR（false discovery rate）≤0.001來最終決定差異檢驗(yàn)的P值的閾值。本研究中，以FDR≤0.001且存在2倍以上表達(dá)差異作為判斷基因表達(dá)差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 油茶種子油脂合成過程中磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)及其相關(guān)基因

油茶種子果實(shí)膨大期和油脂合成高峰期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)幾乎包含了與油茶油脂合成相關(guān)的所有基因的mRNA信息。轉(zhuǎn)錄組中Unigenes序列的基因注釋信息確定了油茶種子發(fā)育過程中相關(guān)基因參與的生理過程、調(diào)控位點(diǎn)及表達(dá)狀況。從油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析可知，PI信號(hào)系統(tǒng)Unigene序列共212條，綜合分析各Unigene序列的NR、Swissport、Pathway、COG和Gene Ontology（GO）基因注釋信息，并對(duì)Unigene序列按功能進(jìn)行分類，可以確定212條Unigene序列編碼調(diào)控油茶種子磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)的關(guān)鍵酶有12種，分屬于12種基因，分別為：磷脂酰肌醇4-激酶（PI4K）；磷脂酰肌醇3-激酶 （PI3K）； 磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸-3-磷酸酶（PTEN）；磷脂酰肌醇合成酶（PIS）；磷脂酰肌醇（3）4-磷酸-5-激酶（PIP5K）；磷脂酶 C（PLC）、肌醇-三磷酸-激酶（ITPK）；肌醇單磷酸酶（IMP）；3'（2'），5'-二磷酸-核苷酶；二酰基甘油激酶（DGK）；磷脂酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶；鈣調(diào)蛋白質(zhì)（Calm）等基因。其中PLC、ITPK、PIP5K、DGK等表現(xiàn)出多基因家族特征。12種基因的油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫基本信息見表1。可看出，油茶種子PI信號(hào)傳遞過程關(guān)鍵基因中，ITPK基因在油茶種子發(fā)育過程中表達(dá)量最大，RPKM（Reads Per Kilobases per Millionreads） 值 最 大 達(dá)162.373 5，其次是Calm，RPKM最高值達(dá)156.316 9，1-磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶基因表達(dá)量最低，RPKM 僅為 7.955 2～35.400 2。

2.3 油茶種子磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)關(guān)鍵酶功能基因不同時(shí)期的表達(dá)

PI信號(hào)系統(tǒng)在生物的發(fā)育過程和細(xì)胞對(duì)環(huán)境的響應(yīng)過程中都起著重要的作用，分析油茶種子磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)的基因，特別是關(guān)鍵基因的表達(dá)模式，有助于探索其功能。油茶種子果實(shí)膨大期和油脂合成高峰期數(shù)字化表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫分析顯示，油茶種子磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)12種關(guān)鍵基因，在油茶種子不同的發(fā)育時(shí)期都具有表達(dá)特異性。各基因不同時(shí)期表達(dá)詳情見表2。

表2數(shù)據(jù)分析顯示，磷脂酰肌醇4-激酶（PI4K）、磷脂酰肌醇（3）4-磷酸-5-激酶（PIP5K）、肌醇-三磷酸-激酶（ITPK）和鈣調(diào)蛋白質(zhì)（Calm）等基因FDR≤0.001且存在2倍以上表達(dá)差異，屬于油茶種子發(fā)育過程中磷脂酰信號(hào)系統(tǒng)果實(shí)膨大期和油脂合成高峰期表達(dá)差異顯著基因，其中Calm基因在果實(shí)膨大期幾乎無表達(dá)，油脂合成高峰期表達(dá)量比果實(shí)膨大期上調(diào)11倍，和PIP5K、ITPK等同屬于表達(dá)明顯上調(diào)基因，PI4K相對(duì)于果實(shí)膨大期，油脂合成高峰期表達(dá)明顯下調(diào)。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷脂酶 C（PLC）、肌醇單磷酸酶（IMP），以及3'（2'），5'-二磷酸-核苷酶等基因，雖然油脂合成高峰期基因表達(dá)上調(diào)，但上調(diào)幅度不大；磷脂酰肌醇合成酶（PIS）、二酰基甘油激酶（DGK）、磷脂酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶等基因油脂合成高峰期表達(dá)下調(diào)，下調(diào)幅度也不大。這些基因的表達(dá)方式不能歸為有顯著變化的基因表達(dá)模式。磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸-3-磷酸酶（PTEN）基因在不同時(shí)期表達(dá)無明顯變化。

表1 油茶種子磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)主要表達(dá)基因Table 1 Unigenes and related enzyme functional genes regulating Phosphatidylinositol signaling system in transcriptome of Camellia oleifera seeds

表2 油茶種子PI信號(hào)系統(tǒng)關(guān)鍵基因不同時(shí)期表達(dá)差異分析Table 2 Expression difference analysis of key genes in PI signaling system of Camellia oleifera seeds with different stages and the peak stage

結(jié)合已有植物PI信號(hào)途徑研究，從基因功能分析，PI4K、PI3K和PIP5K是PI途徑中調(diào)控磷脂酰肌醇磷酸化的關(guān)鍵基因，其作用底物的磷酸化位點(diǎn)各不相同，PI4K、PI3K分別將PI在4位上和3位上磷酸化產(chǎn)生PI4P和PI3P，進(jìn)一步在PIP5K的調(diào)控下形成磷脂酰肌醇-（3）4、5-二磷酸 （PtdIns（3/4，5）P2）。 PtdIns （4，5）P2是生物細(xì)胞內(nèi)重要的磷酯衍生物，能被PLC催化形成細(xì)胞內(nèi)兩種重要的第二信使分子，水溶性三磷酸肌醇（IP3）和脂溶性二酰基甘油（DG）， 能夠啟動(dòng)和激活細(xì)胞內(nèi)的鈣信號(hào)途徑[1，16]，Ca2+能充當(dāng)中間媒介介導(dǎo)細(xì)胞的多種反應(yīng)過程，通過與細(xì)胞內(nèi)多種酶或蛋自質(zhì)結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞多種重要生理功能，其中Calm是細(xì)胞內(nèi)主要Ca2+受體[20]，研究表明Calm參與了多種生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)，如植物對(duì)環(huán)境刺激的應(yīng)答所表現(xiàn)的抗性，推測(cè)油茶的抗干旱、抗霜凍的特性與油茶Calm基因的表達(dá)相關(guān)。

在擬南芥、水稻等模式植物中，PI4K和PIP5K表達(dá)模式和調(diào)控植物的發(fā)育過程和信號(hào)響應(yīng)等功能已有詳細(xì)研究[17-18]。ITPK可調(diào)控肌醇-三-磷酸（IP3）磷酸化成四磷酸肌醇（IP4）[21]，四磷酸肌醇可以使細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流而升高胞內(nèi)Ca2+濃度，調(diào)節(jié)細(xì)胞生理生化過程[22]。有報(bào)道表明，PI3K不但具有肌醇磷脂激酶活性，而且還具有蛋白激酶的活性，在細(xì)胞增殖、遷移和分泌等生物作用中起重要的作用[19]。很明顯 ITPK、PI4K、PI3K、PIP5K 和 PLC 等基因是調(diào)控油茶種子IP信號(hào)系統(tǒng)上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵基因。在油茶種子發(fā)育過程中，PI3K表達(dá)平穩(wěn)且不同時(shí)期表達(dá)量不大，PI4K基因盡管在油脂合成高峰期表達(dá)明顯下調(diào)，但其在油茶種子發(fā)育不同時(shí)期始終高豐度表達(dá)，PLC和PIP5K基因果實(shí)膨大期表達(dá)量較大且隨著油茶種子發(fā)育成熟表達(dá)上調(diào)，顯示與PI4K基因表達(dá)協(xié)同一致。與此相對(duì)應(yīng)，Calm基因和ITPK基因表達(dá)模式應(yīng)與PIP5K或PLC一致，這由表2數(shù)據(jù)可得到充分證明。Gillaspy等研究表明，以上過程形成的不同種類的磷脂酰肌醇-多磷酸可以作為植物體內(nèi)重要的信號(hào)分子參與調(diào)控植物不同的生理活動(dòng)。從油茶種子果實(shí)膨大期（6月）到油脂合成高峰期（8、9月），油茶種子油脂積累處于逐漸上升趨勢(shì)。油茶種子發(fā)育過程中油脂成功積累過程需要植物細(xì)胞內(nèi)各生理過程協(xié)調(diào)作用，PI信號(hào)系統(tǒng)上游反應(yīng)過程中各基因的表達(dá)促使形成不同種類的磷脂酰肌醇-多磷酸，作為植物體內(nèi)重要的信號(hào)分子可以參與調(diào)控油茶種子發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答過程中各種生理活動(dòng)，從而推動(dòng)油脂積累過程順利進(jìn)行，因此油茶種子PI信號(hào)系統(tǒng)上游反應(yīng)過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)上調(diào)或高豐度表達(dá)與油茶油脂的積累呈正相關(guān)。

磷脂酰肌醇-多磷酸在不同的磷酸酶的作用下還可以去磷酸化，以實(shí)現(xiàn)不同種類磷脂酰肌醇-多磷酸之間的轉(zhuǎn)化和含量的控制[23]，或最終將磷脂酰肌醇-多磷酸去磷酸化重新生成自由肌醇[24]。與此同時(shí)IP信號(hào)系統(tǒng)第二信使分子DG在IP信號(hào)系統(tǒng)下游反應(yīng)過程中還可被DGK和磷脂酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶調(diào)控形成CDP-二酰基甘油（CDP-DG），和磷脂酰肌醇-多磷酸去磷酸化生成的自由肌醇在PIS調(diào)控下可重新合成磷脂酰肌醇，參與下一輪信號(hào)傳導(dǎo)過程[25]。

從表2數(shù)據(jù)分析可發(fā)現(xiàn)，油茶種子PI途徑中含PTEN和IMP兩種磷酸酶基因、DGK基因和PIS基因，且各基因在油茶種子發(fā)育過程不同時(shí)期表達(dá)穩(wěn)定，可推測(cè)油茶種子發(fā)育過程PI信號(hào)系統(tǒng)下游反應(yīng)過程中存在磷脂酰肌醇再生循環(huán)利用過程，這一生理過程保證了PI信號(hào)系統(tǒng)的最初底物供應(yīng)，為油茶種子正常發(fā)育和油脂的積累提供了保障。

目前PTEN、IMP和PIS在擬南芥中均發(fā)現(xiàn)多種基因，各基因均表現(xiàn)不同的生理功能[17]。DGK在多種動(dòng)植物中均已有研究，且表現(xiàn)為多基因特征，例如擬南芥基因組中有7個(gè)，哺乳動(dòng)物有9個(gè)[26]。油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，油茶種子DGK基因也表現(xiàn)出多基因家族特征。

3 結(jié)語

高通量測(cè)序技術(shù)獲得油茶種子轉(zhuǎn)錄組和果實(shí)膨大期及油脂合成高峰期表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，為油茶的分子生物學(xué)研究提供了數(shù)字化信息平臺(tái)。要想獲得其中的信息，需要進(jìn)行大量的分析、試驗(yàn)驗(yàn)證工作。生物體內(nèi)PI信號(hào)途徑既能調(diào)控生物細(xì)胞基因表達(dá)，又能調(diào)控生物體對(duì)環(huán)境因素的響應(yīng)，對(duì)生物的生存十分重要。目前植物PI信號(hào)途徑研究報(bào)道不多，油茶種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，油茶種子油脂積累過程中存在PI信號(hào)途徑，且PI途徑中關(guān)鍵基因在油茶果實(shí)膨大期和油脂合成高峰期存在不同表達(dá)模式。從整體上看，油茶種子PI信號(hào)途徑各基因的表達(dá)協(xié)調(diào)進(jìn)行，這有助于油茶種子發(fā)育過程油脂的平穩(wěn)積累，但各環(huán)節(jié)的基因調(diào)控和生理變化，以及與油脂合成及積累的關(guān)系，有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證和深入研究。

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