陳海旭,趙麗芹,贠婷婷,劉珊,李怡然,楊志清,綦文濤
1(國家糧食局科學(xué)研究院,北京,100037)2(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特,010018)
糙米是指除了外殼之外都保留的全谷粒,具有完整生命力,含有豐富的膳食纖維和礦物質(zhì)[1]。但由于糙米在脫去殼后仍然保留有部分外層組織,故口感較為粗糙,質(zhì)地緊密,蒸煮費時,口感不如精白米好,所以并不受大眾喜愛。糙米中約64%的營養(yǎng)元素都積聚于種皮和胚芽中[2-3]。但由于人們過度追求大米的“精”與“白”,使得大米在精加工過程中除去種皮,導(dǎo)致大量營養(yǎng)的損失,同時也造成了食物營養(yǎng)資源的極大浪費[4-6]。
本文針對全谷物飲料研究的空白,利用益生菌發(fā)酵,通過實驗篩選適宜發(fā)酵的菌種及菌種組合,將糙米經(jīng)過糊化、發(fā)酵等工藝制作成發(fā)酵糙米飲料。以期為開發(fā)既保留糙米中的營養(yǎng)物質(zhì),又改善了適口性和滋氣味的健康飲品,同時也為全谷物食品更廣泛的研究與推廣提供理論依據(jù)。
糙米:國家糧食局科學(xué)研究院提供;嗜酸乳桿菌、唾液乳桿菌、雙歧桿菌、德式乳桿菌、釀酒酵母:國家糧食局科學(xué)研究院菌種保藏室保存;干酪乳桿菌:分離于自然發(fā)酵的糙米漿。
將實驗菌株按2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)48 h,連續(xù)活化3代后,以2%的接種量接種于脫脂牛奶中,37℃培養(yǎng)48 h進行菌種馴化,離心,清洗后轉(zhuǎn)移到MRS培養(yǎng)基中待用。
Foss 2300 Kjeltec全自動蛋白儀、Foss soxtec2050脂肪檢測儀、Foss Fibertec 2010粗纖維測定儀,丹麥FOSS公司;Agilent 1260高效液相色譜儀,Agilent公司;L-8800氨基酸自動分析儀,日立公司;Parr 6300 calorimeter能量儀,美國PARR公司;Horizontal Basis超凈臺,Thermo Scientific;LVDVC型黏度計,美國Brookfield公司;雷磁pHS-25 pH檢測計,上海精密科學(xué)儀器有限公司;SBA-40C生物傳感分析儀,山東省科學(xué)研究院生物研究所;DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海科技試驗設(shè)備有限公司。

1.4.1 乳酸含量測定
使用SBA-40C型乳酸-葡萄糖生物傳感分析儀根據(jù)葡萄糖氧化酶固定化膜和氧電極組成的葡萄糖酶電極進行測定,使用乳酸-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品進行標(biāo)定后,進樣20 μL,將讀數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即得乳酸含量。
1.4.2 pH值的測定
使用雷磁pHS-25 pH檢測計,經(jīng)pH標(biāo)準(zhǔn)緩沖液標(biāo)定后測定,結(jié)果取小數(shù)點后2位。
1.4.3 水溶性小肽含量的測定[7]
采用液相色譜法測定發(fā)酵產(chǎn)品中小肽含量:
(1)色譜條件
色譜柱:TSKgel G2000SWXL 300 mm×7.8 mm凝膠排阻柱;流動相:V(水)∶V(三氟乙酸)=1 000∶1;檢測波長UV215 nm;流速1.0 mL/min;進樣體積10 μL。
(2)樣品制備
吸取各組發(fā)酵后產(chǎn)品的上清液5 mL,12 000 r/min離心 60 s,吸取 1 mL離心后的上清液,過0.45 μm的水系膜后,濾液放入樣品瓶中上機待測。
1.4.4 氨基酸含量的測定[8]
采用日立L-8800氨基酸自動分析儀分析發(fā)酵產(chǎn)品中小肽含量變化情況,具體包括以下步驟:
(1)實驗試劑的配制
按照儀器要求配制標(biāo)準(zhǔn)分析用 B1、B2、B3、B4、B5洗脫溶液、茚三酮試劑和茚三酮緩沖溶液。泵1(洗脫溶液)流速:0.40 mL/min;泵2流速:0.35 mL/min;分析柱溫度:57℃;反應(yīng)器溫度:135℃;進樣體積:20 μL。洗脫溶液、茚三酮試劑和茚三酮緩沖溶液配制方法如下:
茚三酮試劑:稱取39 g茚三酮,溶于979 mL乙二醇甲醚中,過0.45 μm有機系微孔濾膜。
茚三酮緩沖液:稱取無水醋酸鈉204 g,冰醋酸123 mL,乙二醇甲醚401 mL,加超純水溶解后,定容至1 L,過0.45 μm有機系微孔濾膜。

洗脫溶液試劑B1 B2 B3 B4 B5超純水/mL 700 700 700 700 700檸檬酸三鈉/g 6.19 7.74 13.31 26.67 -NaCl/g 5.66 7.07 3.74 54.35 -檸檬酸/g 19.80 22.00 12.80 6.10 -無水乙醇/mL 135.0 25.0 9.0 - 100.0 NaOH/g - - - - 8.00定容/L 1 1 1 1 1
(2)標(biāo)準(zhǔn)品的配制
取AAS-18氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)1 mL,用0.1 mol/L的 HCl溶液稀釋至 25 mL,移取此稀釋液1 mL,過0.45 μm微孔濾膜,濾液入樣品瓶中上機待測。
(3)樣品的制備
稱取蛋白質(zhì)含量為7.5~25 mg的試樣加6 mol/L HCl 15 mL,吹氮氣封口后于110℃恒溫箱中酸解22 h后,吸取200 μL酸解液加入樣品瓶中,氮氣吹干,然后加入200 μL去離子水用氮氣吹干,重復(fù)此步驟3遍后,加入1.5 mL檸檬酸鈉緩沖液并過0.45 μm濾膜后上機待測。
1.4.5 粗蛋白含量的測定
使用Foss 2300 Kjeltec凱式定氮儀,根據(jù)GB/T 14489.2-2008的標(biāo)準(zhǔn),準(zhǔn)確量取3 mL發(fā)酵后的樣品,加入15 mL濃H2SO4及2片消化片,420℃消化至液體變?yōu)橥该魉{色后冷卻至室溫上機測定。
1.4.6 粗脂肪含量的測定
使用 Foss soxtec2050脂肪檢測儀,根據(jù) GB/T 5512-2008的標(biāo)準(zhǔn),準(zhǔn)確稱取5 g左右的烘干后的發(fā)酵樣品,加入20 mL丙酮,上機設(shè)置循環(huán)溫度后,進行測定。
1.4.7 能量的測定
使用Parr 6300 calorimeter能量儀,稱取1.00 g左右的樣品,放入儀器特制的燃燒盒中,使用壓片器將樣品壓實,放入引線后上機進行測定。
1.4.8 碳水化合物的測定
碳水化合物/%=[100%-(蛋白質(zhì)含量+脂肪含量+水分含量+灰分含量+膳食纖維含量)]×100
1.4.9 膳食纖維的測定
根據(jù)GB/T 5009.88-2008的方法進行檢測。
1.4.10 活菌數(shù)的測定
按照確定的工藝參數(shù)制備飲料,對發(fā)酵后的最終產(chǎn)品做活菌計數(shù),采用 MRS瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24~48 h,每組發(fā)酵產(chǎn)品平行測定3次,計算活菌數(shù)目的平均值,結(jié)果以CFU/mL計。
清洗:將糙米去雜后,放入濃度為1%的NaClO2溶液中浸泡5 min后用蒸餾水沖洗干凈,對糙米進行初步的清洗消毒。
粉碎:將糙米用粉碎機粉碎至過30目篩。
糊化:按料液比1∶10的比例105℃糊化20 min。
均質(zhì):使用高壓均質(zhì)機在30 MPa的壓力均質(zhì)一次。
灌裝、滅菌:將料液分裝入500 mL的Schott瓶中,121℃滅菌 15 min。
接種:在微生物潔凈工作臺內(nèi),將冷卻分裝后的料液按照一定比例接入預(yù)處理過的種子液。
發(fā)酵:在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),37℃發(fā)酵12 h。
調(diào)配:在微生物潔凈工作臺內(nèi),向產(chǎn)品中加入一定比例的蜂蜜。
本文最終數(shù)據(jù)均來自于3次發(fā)酵實驗的樣品平行測定3次,所得實驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行處理,用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 的形式表示,并通過單向方差和t檢驗進行顯著性統(tǒng)計分析,其中P<0.05認為數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異(*);P<0.01認為數(shù)據(jù)之間差異極顯著(**),n為實驗次數(shù)。
圖1為6種不同益生菌菌株的初步糙米發(fā)酵結(jié)果。由圖1可以看出,不同菌種發(fā)酵后產(chǎn)品中的乳酸含量有一定差異。其中干酪乳桿菌、唾液乳桿菌和雙歧桿菌發(fā)酵后產(chǎn)品的乳酸含量均在15 mmol/L以上,其次為嗜酸乳桿菌,含量為13.83 mmol/L,而德式乳桿菌和釀酒酵母的乳酸含量較低,分別為9 mmol/L和7.5 mmol/L。在相同發(fā)酵條件下,德式乳桿菌和釀酒酵母的產(chǎn)乳酸能力明顯低于其他4株菌種。同時由此圖可以看出,發(fā)酵可以顯著降低產(chǎn)品的pH值。6株菌種發(fā)酵后的pH值都比對照組(pH 6.5)低,其中德式乳桿菌和釀酒酵母的pH值為6株菌中最高的,分別為5.87和5.48,而嗜酸乳桿菌和唾液乳桿菌的發(fā)酵最終酸度是6株菌中最低的,分別為4.67和4.68,說明這2種菌對酸度具有更高的耐受性,能夠更好地利用糙米中的營養(yǎng)物質(zhì)在低pH環(huán)境下產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。而干酪乳桿菌和雙歧桿菌的pH值分別為5.04和4.94。市售的發(fā)酵飲品中,無論是發(fā)酵乳制品還是發(fā)酵米酒等制品,其發(fā)酵的最終pH值大約都在3.9~4.2之間[9],因此,單一菌種發(fā)酵后產(chǎn)品的乳酸含量較低,pH值較高,且無法達到豐富濃郁的口感。鑒于干酪乳酸桿菌、嗜酸乳桿菌、唾液乳桿菌和雙歧桿菌的發(fā)酵效果要明顯好于德式乳桿菌和釀酒酵母,本文接下來研究將選用這4株菌種進行混合復(fù)配發(fā)酵試驗,以篩選出發(fā)酵效果最好的菌種組合。

圖1 單一菌株發(fā)酵后的乳酸含量及pH值Fig.1 The content of lactic acid and pH after single strain fermentation
復(fù)配菌種發(fā)酵后的乳酸含量及pH值如圖2所示。由圖2可見,在乳酸產(chǎn)量和pH值變化方面混菌發(fā)酵效果明顯較單菌發(fā)酵好,且3種菌混合發(fā)酵組合的平均乳酸含量顯著高于雙菌混合發(fā)酵結(jié)果,乳酸最高的組合B+SS+SQQ組,其含量高達42.6 mmol/L,高濃度的乳酸含量賦予了產(chǎn)品濃郁的發(fā)酵風(fēng)味。與此同時,雙菌發(fā)酵的pH值較3種菌發(fā)酵的pH值偏高,在相同培養(yǎng)時間內(nèi)pH值降低速率更慢。而發(fā)酵12 h后的3種菌復(fù)配發(fā)酵產(chǎn)品的pH值已經(jīng)顯著降低,并達到與市售發(fā)酵制品(pH=3.92)相當(dāng)?shù)膒H值,充分說明3種菌復(fù)配的發(fā)酵效果的要好于雙菌復(fù)配發(fā)酵。因此,本文進一步深入分析了復(fù)配發(fā)酵糙米飲料的營養(yǎng)價值和工藝參數(shù)。

圖2 復(fù)配菌株發(fā)酵后乳酸、pH值含量圖Fig.2 The content of lactic acid and pH of mixing strain fermentation
本文采用歸一化法進一步分析了復(fù)配菌種發(fā)酵后的糙米飲品中水溶性肽的含量情況,由圖3可以看出,發(fā)酵后的各組在分子質(zhì)量1 800~10 000Da的水溶性多肽的峰面積明顯大于未發(fā)酵的對照組,可以說明發(fā)酵后糙米食品中的多肽和小分子蛋白質(zhì)含量有所增多。
表1顯示了各發(fā)酵菌種組合在此分子質(zhì)量區(qū)間的面積相比于未發(fā)酵的對照組的增長率平均達到400%左右,即為對照組的4倍左右,其中組合B+SS+SQQ組的增長率最高,達到了對照組的4.3倍。而分子質(zhì)量在600~1 800Da區(qū)間內(nèi)的小肽的峰面積中,發(fā)酵組也高于對照組,且增加率更是平均高達961%之多。充分說明發(fā)酵過程對水溶性肽類物質(zhì)的增加起到了重要的作用。

表1 不同菌種組合發(fā)酵前后水溶性肽類物質(zhì)面積增長率Table 1 The growth area rate of water-soluble peptides after mixing strain fermentation

圖3 不同菌種復(fù)配發(fā)酵后的水溶性肽變化圖Fig.3 The graph of water soluble peptide after fermentation by mixing strain
表2為4組3種菌混合復(fù)配發(fā)酵后的糙米飲料中的總氨基酸及主要氨基酸含量的變化情況。由表2可見,在總氨基酸含量上,組合干酪乳桿菌+嗜酸乳桿菌+雙歧桿菌的總氨基酸量(1 179 mg/100g)較對照組氨基酸總量(930 mg/100 g)增長了26.74%,為4個菌種組合中總氨基酸含量增加最多的一組,該組合發(fā)酵后的產(chǎn)品中,使用酸水解法可以檢測出的7種人體必需氨基酸全部高于未發(fā)酵對照組,平均增加率為39.97%,而參與蛋白質(zhì)合成的人體必需氨基酸——蛋氨酸的增加率更是高達73%。由于人體內(nèi)不能合成必需氨基酸而只能通過食物獲取,因此必需氨基酸的增加有利于提高其在人體中的吸收率,促進人體的健康發(fā)展。在該發(fā)酵組合的產(chǎn)品中,除胱氨酸和甘氨酸外,發(fā)酵后產(chǎn)品中的非必需氨基酸含量全部高于未發(fā)酵對照組,平均增加率為25.64%。

表2 復(fù)配菌株發(fā)酵前后產(chǎn)品氨基酸含量 mg/100gTable 2 The amino acid content on mixing strain fermentation mg/100g
通過乳酸、pH值、氨基酸含量、水溶性肽含量的綜合比較和分析,發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌+干酪乳桿菌+雙歧桿菌組合發(fā)酵后的氨基酸、水溶性小肽含量高于其他3個菌種組合,符合當(dāng)代人對食物的選擇標(biāo)準(zhǔn):既味美價廉又低脂、高纖維、高營養(yǎng),故最終選擇該組合為發(fā)酵糙米飲料的復(fù)配菌種組合。因此,本文進一步對該菌株復(fù)配組合發(fā)酵糙米的工藝進行了優(yōu)化研究。
2.4.1 料水比的確定
料水比不同,發(fā)酵后產(chǎn)品的黏度有顯著差異,如圖4所示。其中,料水比50∶1 000組的黏度過低,靜置30 min后產(chǎn)品上下分層嚴(yán)重,難以形成穩(wěn)定的懸浮體系;料水比為100∶1 000的發(fā)酵產(chǎn)品的黏度為24.87 mPa·s,與市售谷物飲料黏度(20.88 mPa·s)相比略高,其發(fā)酵后無明顯分層,有較強的流動性。料水比150∶1 000組的黏度為34.29 mPa·s,明顯高于市售對照組,發(fā)酵后產(chǎn)品無明顯分層,但流動性要低于100∶1 000組。而料水比200∶1 000組的產(chǎn)品基本無流動性,其黏度更是高達98.05 mPa·s,流動性較差,不適宜用此比例制作飲料。從節(jié)約原材料的成本角度考慮,選擇料水比為100∶1 000進行發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)更合適。

圖4 料水比對產(chǎn)品黏度的影響Fig.4 Effect of viscosity in different water mixture fermented products
2.4.2 發(fā)酵時間的確定
發(fā)酵時間的長短會直接影響產(chǎn)品的乳酸含量和風(fēng)味,發(fā)酵時間短,產(chǎn)酸量不足,發(fā)酵氣息不足,達不到合適的感官體驗;發(fā)酵時間長,產(chǎn)酸過多且容易產(chǎn)生刺激性酸味,pH值過低,而且發(fā)酵周期長,會使發(fā)酵成本增加。由圖5可以看出,發(fā)酵時間的長短對產(chǎn)品的乳酸含量和pH值具有一定影響。隨著時間的延長,產(chǎn)品內(nèi)富集的乳酸含量逐漸增多,發(fā)酵24 h左右,產(chǎn)品的乳酸含量為26.75 mmol/L,此時乳酸增加最快,增幅達到52%。同時,pH值在此時間段內(nèi)下降最快,由4.45下降至4.18。該時間段的產(chǎn)品已具有濃郁的發(fā)酵氣息,滋味偏酸,呈淺乳白色。當(dāng)發(fā)酵至36h時,乳酸含量為52.17 mmol/L,pH值為3.99,此時產(chǎn)品的發(fā)酵氣味偏酸,口感較酸,且?guī)в幸欢ǖ臐丁S纱丝梢姡瑔渭冏非蟀l(fā)酵時間并不一定能夠提升產(chǎn)品的發(fā)酵口感。

圖5 發(fā)酵時間對產(chǎn)品的影響Fig.5 Effect of lactic acid and pH after different fermented time
2.4.3 接種量的確定
隨著接種量的增大,產(chǎn)品的乳酸含量呈現(xiàn)逐步上升的趨勢,而pH值呈現(xiàn)下降的趨勢。這主要是由于,隨著接種量的增加,起始發(fā)酵液中的乳酸菌活菌數(shù)隨之增加,產(chǎn)酸能力強,乳酸含量上升較快,pH值下降也較快,而隨著接種量繼續(xù)增大,產(chǎn)酸過多,pH值過低,反而抑制了菌體的活性,導(dǎo)致乳酸的增長速度放緩,另一方面也許是由于菌種數(shù)目過多,相互競爭加大,對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭導(dǎo)致菌體生長活性降低。例如圖6中,接種量為5%的乳酸含量較4%的接種量的乳酸含量增加了18 mmol/L,pH值降低了0.3,而接種量6%的乳酸含量較接種量5%的乳酸含量僅增長了4.2 mmol/L,pH值僅降低了0.05,基本無變化。這一結(jié)果與潘廷跳等[10]在制作攪拌型燕麥酸奶中的結(jié)果相似。他們發(fā)現(xiàn)在一定的范圍內(nèi),隨著乳酸菌接種量的增大,感官評定的分?jǐn)?shù)就越高,而達到頂峰之后,分?jǐn)?shù)又減小。他認為接種量過低時,在一定的時間內(nèi)乳酸菌的繁殖生長能力有限,不能充分發(fā)酵而導(dǎo)致發(fā)酵不完全;而接種量過高時,在較短一段時間內(nèi)產(chǎn)生較多的乳酸,導(dǎo)致酸度過大。所以5%左右的接種量最為適合發(fā)酵糙米飲料。
根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以料水比、發(fā)酵時間、接種量,選取發(fā)酵后產(chǎn)品的乳酸含量作為評價指標(biāo),采用L9(34)正交設(shè)計對工藝條件進行優(yōu)化。因素水平見表3,結(jié)果見表4。

圖6 接種量對發(fā)酵產(chǎn)品的影響Fig.6 Effect of lactic acid and pH on different inoculation

表3 發(fā)酵糙米飲料工藝正交試驗因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment on fermentation of brown rice beverage

表4 發(fā)酵糙米飲料工藝正交試驗結(jié)果Table 4 The result of orthogonal experiment on fermentation factors of brown rice beverage
由表4看出,影響發(fā)酵后產(chǎn)品的乳酸含量的因素主次順序為:料水比>接種量>發(fā)酵時間,按各因素水平應(yīng)選擇組合A2B3C3作為最佳發(fā)酵組合,即接種量5%,料水比為120∶1000,發(fā)酵時間為16 h。3號(A1B2C3)、4號組合(A2B1C2)的乳酸含量最高,為了得到最佳發(fā)酵組合,將這2個組合與極差分析得到的組合N(A2B3C3)做發(fā)酵重復(fù)試驗。結(jié)果見表7。

表5 發(fā)酵糙米飲料最佳工藝參數(shù)重復(fù)試驗Table 5 Result of repeated test on fermentation factors of brown rice beverage
對發(fā)酵后的糙米飲料立即進行營養(yǎng)成分及活菌數(shù)的測定,通過糙米飲料發(fā)酵前后的營養(yǎng)數(shù)據(jù)對比可以看出,發(fā)酵后的產(chǎn)品蛋白質(zhì)有所提高,脂肪、碳水化合物、能量及膳食纖維含量有所下降,如表6所示。碳水化合物的下降是由于發(fā)酵過程中乳酸菌的生長代謝對碳水化合物的利用所導(dǎo)致的,膳食纖維和脂肪含量的下降來源于加工過程中高溫條件對其的破壞。而發(fā)酵的糙米飲料與市售飲料對比可以看出,蛋白質(zhì)含量較谷物飲料略顯不足,但高出乳酸菌飲料。脂肪含量雖然高于乳酸菌飲料但遠遠低于谷物飲料中的脂肪含量。碳水化合物和能量的含量均低于市售飲料,發(fā)酵糙米飲料呈現(xiàn)為低能量的狀態(tài)。反觀膳食纖維含量,發(fā)酵糙米飲料的膳食纖維含量是市售谷物飲料的3.2倍,在每天正常飲食范圍內(nèi)再多補充300mL發(fā)酵糙米飲料大約便可滿足成人膳食纖維的日平均攝入量。同時,發(fā)酵糙米飲料與市售乳酸菌飲料相比含有更多的活菌數(shù)目,又由3種益生菌復(fù)配發(fā)酵而成,菌種種類多,活性好,更有助于人體腸道菌群的平衡,保持腸胃年輕。

表6 發(fā)酵糙米飲料與市售飲料的營養(yǎng)成分對比Table 6 Comparison of nutrients between fermented brown rice beverage and market sale beverages
三菌復(fù)配混合發(fā)酵較單菌和雙菌混合發(fā)酵更利于健康、營養(yǎng)、美味全谷物糙米飲料的開發(fā)。單因素和正交試驗表明嗜酸乳桿菌+干酪乳桿菌+雙歧桿菌組合發(fā)酵糙米的最佳工藝為:接種量為5%,料水比為120∶1 000,于37℃發(fā)酵16 h,所得的發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味濃郁清香,有較適宜的酸度,口感醇厚。與市售谷物飲料和乳酸菌飲料進行營養(yǎng)成分分析對比,最佳菌種組合和工藝條件下發(fā)酵糙米飲料的蛋白質(zhì)、膳食纖維含量均高于市售飲料,而脂肪、碳水化合物、能量含量低于市售飲料,產(chǎn)品的營養(yǎng)全面、均衡,適宜現(xiàn)代人對營養(yǎng)的需求,活菌數(shù)更是達到1.2×108cfu/mL,是一種具有很好開發(fā)潛力的營養(yǎng)全面、風(fēng)味獨特、健康的全谷物飲品。
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