超聲協(xié)同CDA酶法制備龍蝦殼聚糖*

竇勇，胡佩紅

1(江蘇財經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安，223003)2(淮安正昌飼料有限公司，江蘇淮安，223005)

殼聚糖(chitosan)又稱脫乙酰甲殼素，是由甲殼素經(jīng)脫乙酰基而得，化學(xué)名聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，是天然多糖中唯一的堿性多糖，廣泛用于紡織、醫(yī)藥、造紙、化妝品、食品工業(yè)和生物技術(shù)等領(lǐng)域［1］。一般把N-脫乙酰度55%以上的甲殼素(能溶解于1%的乙酸或1%的HCl中)稱為殼聚糖，低于55%的仍稱為甲殼素;根據(jù)脫乙酰度不同，將殼聚糖分為高(85% ～95%)、中(70% ～85%)、低(55%～70%)脫乙酰度3類［2-3］。目前，國內(nèi)外有關(guān)殼聚糖制備報道十分廣泛，其主要制備方法是傳統(tǒng)的高濃度強堿法，近年來不少研究學(xué)者采用微波法、超聲波法有機溶劑介質(zhì)法等方法制備殼聚糖，但這些方法仍然離不開強堿的作用，其反應(yīng)時間長，能耗高，產(chǎn)品性質(zhì)不穩(wěn)定，對環(huán)境造成污染極大［4-7］。

我國淡水資源十分豐富，是淡水小龍蝦養(yǎng)殖和加工大國，每年產(chǎn)生的淡水小龍蝦加工廢棄物數(shù)以噸計，既污染環(huán)境又浪費了資源。顯然，為充分利用蝦殼自然資源，減少環(huán)境污染，以淡水小龍蝦加工廢棄物為原料，開發(fā)高效、無污染的環(huán)境友好型的殼聚糖生產(chǎn)方法勢在必行。本研究旨在以淡水小龍蝦殼為原料，利用超聲波“空化作用”，改善甲殼素脫乙酰基酶(Chitin Deacetylation，簡稱CDA)與甲殼素之間的相互作用，利用CDA酶的高效催化性和專一性，提高脫乙酰反應(yīng)速度和脫乙酰度，通過響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝參數(shù)，建立環(huán)境友好型的酶法制備高脫乙酰度殼聚糖的最佳工藝，為環(huán)境友好型的酶法工業(yè)化生產(chǎn)殼聚糖奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

淡水小龍蝦，購于淮安市城南農(nóng)貿(mào)市場;Na2·EDTA、NaOH、雙氧水等試劑均購于國藥化學(xué)試劑有限公司，均為分析純;CDA粗酶液(采用1.3.3方法測定酶活力為195.34 U/mL，實驗室自制:從淮安市某淡水小龍蝦養(yǎng)殖基地淤泥中篩選出1株高產(chǎn)CDA酶霉菌，經(jīng)鑒定為構(gòu)巢曲霉菌，將該菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)96 h后，所得發(fā)酵液低溫離心后取上清液，即為CDA粗酶液)。

1.2 主要儀器

多功能超聲波清洗機(SCQ-1000C)，上海汗諾儀器有限公司;粉碎機(JYL-305)，山東九陽小家電有限公司;恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHZG-9070A)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋(HWS-28)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;數(shù)顯黏度計(NDJ-8S)，上海方瑞儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 超聲協(xié)同CDA制備殼聚糖工藝

蝦殼樣品預(yù)處理→超聲輔助EDTA脫鈣脫蛋白→過濾→烘干→雙氧水脫色→水洗至中性→烘干→甲殼素→超聲協(xié)同CDA酶法脫乙酰→過濾→水洗至中性→烘干→殼聚糖

1.3.2 脫乙酰度、黏度的測定和殼聚糖得率計算［6-7］

脫乙酰度(D.D.)測定參考文獻［6］方法進行，黏度測定參考文獻［7］方法進行。殼聚糖得率計算按公式(1)計算:

1.3.3 CDA酶活單位定義［8］

［8］，采用分光光度法測定酶活，以每小時產(chǎn)生1 μg對硝基苯胺所需要的酶量定義為1個酶活力單位(粗酶液酶活單位:U/mL)。

1.3.4 傳統(tǒng)堿法制備淡水小龍蝦殼聚糖

參考文獻［9］“一步法”殼聚糖制備方法，采用1.3.2、1.3.3方法測其D.D.值、黏度及相對得率。

1.3.5 超聲波法制備淡水小龍蝦殼聚糖［7］

稱取5 g左右自制甲殼素粉末，加入盛有80 mL 50%NaOH的燒杯中，并置于超聲波清洗機中，經(jīng)超聲波(頻率40 kHz，功率400 W)預(yù)處理1 h后，在90℃下恒溫攪拌反應(yīng)10 h，結(jié)束后冷卻至室溫，過濾，用水反復(fù)沖洗至中性，烘干即為殼聚糖，采用1.3.2、1.3.3方法測定其D.D.值、黏度及相對得率。

1.3.6 超聲協(xié)同CDA酶法制備淡水小龍蝦殼聚糖［10-13］

將自制甲殼素粉碎過40目篩于燒杯中，按料液比1∶20加入蒸餾水，于100℃水浴中加熱預(yù)處理1 h后，置于超聲波清洗機中，在一定超聲功率下，經(jīng)超聲波預(yù)處理60 min后，加入CDA粗酶液，磁力攪拌水浴于50℃下恒溫酶解一定時間，期間以0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH 7.5，以使酶活性最高，酶反應(yīng)結(jié)束后，以100℃水浴下連續(xù)滅活15 min終止酶反應(yīng)，迅速冷卻至室溫，9 000 r/min離心10 min，蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，沉淀物烘干，即得殼聚糖，采用1.3.2、1.3.3方法測定其D.D.值、黏度及相對得率。

1.3.7 RSM 優(yōu)化設(shè)計［11，14］

采用Design Expert 8.0.5軟件，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，以脫乙酰度Y為響應(yīng)值，從預(yù)試驗結(jié)果中選取加酶量、酶解時間、超聲功率3個對D.D值影響較大因素設(shè)計試驗，以期獲得高D.D.的最佳條件，因素水平設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計試驗因素水平編碼表Table 1 Box-Behnken design factors and levels code table

2 結(jié)果與分析

2.1 模型建立及其顯著性檢驗

RSM分析試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，利用Design Expert 8.0.5軟件對表2數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到脫乙酰度(Y)對此3因素編碼值的二次多項回歸模型為:Y=-319.632+0.717 5X1-0.772 5X2-0.467 5X3+0.98X1X2-0.44X1X3-0.885X2X3-5.718X12-2.248X22-2.998X32。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experiment design and results

該模型方差分析與回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表3，模型P＜0.000 1，差異極顯著;失擬項P=0.100 2＞0.05，差異不顯著，說明該模型對實際試驗擬合度好，試驗誤差小。方差分析結(jié)果顯示，決定系數(shù)R2=0.991 4校正系數(shù)，信噪比(Adeq Precision)=25.22遠大于4，表明模型預(yù)測值與實際值擬合良好，可信度均很高，能夠很好用于超聲協(xié)同CDA酶法制備殼聚糖的D.D.的分析和預(yù)測。表3數(shù)據(jù)可見，一次項中X1、X2偏回歸系數(shù)差異高度顯著，說明超聲功率、加酶量對本法制備的殼聚糖D.D.有高度顯著的影響，X3偏回歸系數(shù)差異顯著，說明酶解時間對殼聚糖D.D.影響顯著。交互項中除X1X2影響高度顯著，X2X3影響顯著，而X1X3交互作用不明顯，說明超聲功率和加酶量交互作用對D.D.影響最大，加酶量與酶解時間交互作用對D.D.影響顯著，而超聲功率與酶解時間交互作用對其影響很小。由F值可以看出，以上3因素對殼聚糖D.D.的影響順序為:加酶量＞超聲功率＞酶解時間。

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA results of regression equation

2.2 RSM分析

利用Design Expert 8.0.5軟件作響應(yīng)曲面及等高曲線，考察所擬合的響應(yīng)面形狀，分析超聲波功率、加酶量、酶解時間3因素之間交互作用對殼聚糖D.D.的影響，其響應(yīng)曲面及等高曲線如圖1～圖3所示。

2.2.1 超聲波功率與加酶量交互關(guān)系

由圖1可以看出，當酶解時間一定時，隨著超聲功率的增大，D.D.先升高后降低，變化幅度很大，說明在一定范圍內(nèi)提高超聲功率有利于甲殼素脫乙酰基，而超聲功率過大，可能造成空化氣泡在負相位受壓過大而直接破裂，減小甚至失去超聲“空化作用”［15］，從而不利于甲殼素的脫乙酰基。而加酶量對其影響較小，等高線呈橢圓形，說明超聲波功率與加酶量交互作用明顯。

圖1 超聲波功率與加酶量交互作用的響應(yīng)面與等高曲線圖Fig.1 Response surface and high profile of the interaction between ultrasonic power and enzyme dosage

2.2.2 超聲波功率與酶解時間交互關(guān)系

從圖2可以看出，當加酶量一定時，隨著超過功率的增大，殼聚糖D.D.均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在適宜的超聲功率下，促進了甲殼素顆粒粉碎，增加其與CDA酶活性中心的結(jié)合幾率，充分發(fā)揮了酶的高效催化活性，D.D.達到最大值;而高功率超聲會產(chǎn)生瞬態(tài)空化作用，空化泡崩潰的瞬間，釋放出高溫高壓，導(dǎo)致大量自由基的形成，高能量的自由基可能直接攻擊CDA酶分子發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，使CDA活力下降，D.D.也隨之降低［16］;而當加酶量一定時，D.D.隨酶解時間的延長呈現(xiàn)平穩(wěn)略有下降趨勢，原因可能是因酶解時間過長，產(chǎn)生大量的乙酸，降低了CDA酶的活性，從而影響了D.D.。此外，右側(cè)等高線呈近圓形，說明等高線呈橢圓形交互作用不明顯。

圖2 超聲波功率與酶解時間交互作用的響應(yīng)面與等高曲線圖Fig.2 Response surface and high profile of the interaction between ultrasonic power and enzymolysis time

2.2.3 加酶量與酶解時間交互關(guān)系

圖3顯示，當超聲功率不變時，隨著酶解時間和加酶量的增加，響應(yīng)面曲線變化幅度不明顯。說明，當超聲功率不適宜時，隨加酶量和酶解時間的變化，酶法脫乙酰基效果不明顯。等高線呈橢圓形，說明等高線呈橢圓形交互作用明顯，當超聲功率適宜時，能充分發(fā)揮超聲與CDA酶的協(xié)同作用。

圖3 加酶量與酶解時間交互作用的響應(yīng)面與等高曲線圖Fig.3 Response surface and high profile of the interaction between enzyme dosage and enzymolysis time

2.3 RSM優(yōu)化結(jié)果與驗證試驗

根據(jù)回歸模型，通過Design Expert 8.0.5軟件分析得出，超聲協(xié)同CDA酶制備殼聚糖的最佳條件優(yōu)化結(jié)果為:超聲功率475.91 W，加酶量9.45%，酶解時間3.5 h;預(yù)期的D.D.為90.98%。為了驗證Box-Behnken試驗設(shè)計的預(yù)測結(jié)果可靠性，根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及預(yù)試驗的最佳條件，結(jié)合實際操作，采用超聲功率476 W、超聲處理時間60 min、加酶量9.45%、酶解溫度50℃、酶解時間3.5 h，進行3組平行試驗制備殼聚糖，所得殼聚糖D.D.的平均值為91.09%，這與響應(yīng)面預(yù)測評分90.98%十分接近，說明該模型預(yù)測結(jié)果與實際結(jié)果相符度、可信度高，具有實用價值。

2.4 超聲協(xié)同酶法與傳統(tǒng)堿法及單一超聲法制備殼聚糖效果比較

從表4可知，超聲協(xié)同CDA酶法制備的殼聚糖D.D.為91.09%，黏度為95 mPa·s，制備時間4.5 h，殼聚糖相對得率為85.87%，可見超聲協(xié)同酶法制備殼聚糖的D.D.、黏度、制備時間和相對得率等產(chǎn)品質(zhì)量參數(shù)明顯比傳統(tǒng)熱堿法、單一超聲法效果好。制備時間來看，超聲協(xié)同酶法，利用了酶的高效催化活性和超聲波的“空化作用”大大降低了脫乙酰基的時間，提高了D.D.，酶法條件溫和也保證產(chǎn)品性質(zhì)穩(wěn)定，其D.D.和黏度明顯高于其他兩種方法，可見采用超聲協(xié)同酶法制備淡水小龍蝦殼高效、可行，制備時間短，產(chǎn)品具有高D.D.、高黏度的優(yōu)點，制備過程中不需添加強酸、強堿，保護了環(huán)境，將成為未來殼聚糖工業(yè)化生產(chǎn)的方向。

3 結(jié)論

本研究在預(yù)實驗基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲協(xié)同酶法制備龍蝦殼聚糖工藝，得到其最佳制備條件為:超聲功率476 W、超聲處理時間60 min、加酶量9.45%、酶解溫度50℃、酶解時間3.5 h，在此工藝條件下，殼聚糖的D.D.高達91.09%、黏度95 mPa·s，相對得率81.87%，總制備時間為4.5 h，產(chǎn)品為白色粉末。本研究采用自制CDA粗酶液，在酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)及其催化脫乙酰機理方面有待于進一步研究。龍蝦殼聚糖的超聲協(xié)同CDA酶制備法具有制備時間短、產(chǎn)品脫乙酰度高、相對得率高的優(yōu)點，其最大優(yōu)勢在于一改長期以來無法脫離強堿制備殼聚糖的現(xiàn)狀，甲殼素提取所使用的 EDTA回收率可達100%，整個制備過程沒有使用強酸、強堿等環(huán)境污染試劑，是一種環(huán)境友好型的制備方法，必將廣泛運用。

表4 不同方法制備殼聚糖效果比較Table 4 Comparison of preparing chitosan effect with different methods

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