傳統(tǒng)農(nóng)家大醬中耐鹽性乳酸菌的分離與鑒定*

徐鑫，王茜茜，王曉蕊，薛亞婷，烏日娜

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)，110866)

大醬是以大豆為主要原材料，利用米曲霉、酵母菌、乳酸菌等微生物，經(jīng)過(guò)幾個(gè)月的自然發(fā)酵，最終形成的半流動(dòng)狀態(tài)的發(fā)酵性食品［1］。大醬又稱(chēng)黃豆醬、大豆醬、黃醬，我國(guó)北方地區(qū)稱(chēng)大醬。其色澤為紅褐色或棕褐色，鮮艷，有光澤;有明顯的醬香和醋香，咸淡適口，呈黏稠適度的半流動(dòng)狀態(tài)。豆醬不僅可以作為調(diào)味品，而且富含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。由于經(jīng)過(guò)發(fā)酵，所以極易被人體吸收。事實(shí)上，它不單是一種調(diào)味品，而且是一種副食品，在人們的日常飲食中占有重要地位，尤其在東北地區(qū)，是一種深受廣大人民歡迎的傳統(tǒng)型發(fā)酵食品。大豆醬的風(fēng)味非常獨(dú)特，其風(fēng)味的形成主要是由發(fā)酵過(guò)程中微生物的生物化學(xué)反應(yīng)引起的，與風(fēng)味形成有關(guān)的微生物群落主要是酵母菌和乳酸菌。

乳酸菌(lactic acid bacteria)是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶反應(yīng)陰性的桿菌或球菌，它不形成芽孢、不運(yùn)動(dòng)，能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生50%以上乳酸的一類(lèi)細(xì)菌的總稱(chēng)［2］。基于形態(tài)學(xué)、不同生長(zhǎng)溫度、葡萄糖發(fā)酵方式、產(chǎn)生乳酸的構(gòu)型、酸或堿的耐受性以及高鹽濃度下的生長(zhǎng)能力對(duì)乳酸菌菌屬進(jìn)行分類(lèi)。目前，乳酸菌在分類(lèi)學(xué)上大致可以分為23個(gè)屬，包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、肉食桿菌屬(Carnobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、氣球菌屬(Aerococcus)，片球菌屬(Pediococcus)、漫游球菌屬(Vagococcus)、奇異菌屬(Atopobium)、李斯特氏菌屬(Listeria)、真絲菌屬(Eubacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)中的少數(shù)種、芽孢乳桿菌屬(Sporolactobacillus)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)、環(huán)絲菌屬(Brochothix)、魏斯氏菌屬(Weissella)、糖球菌屬(Saccharococcus)、孿生菌屬(Gemella)、酒球菌屬(Oenococcus)、營(yíng)養(yǎng)缺陷菌屬(Abiotrophia)［3］。

乳酸菌不僅有利于食品發(fā)酵，改善風(fēng)味，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等功能，而且其作為存在人體內(nèi)的益生菌，還能對(duì)人體的生理功能起到有益的調(diào)節(jié)作用［4］。近年來(lái)對(duì)乳酸菌的研究表明，乳酸菌有很多特殊的保健功能，如改善腸道功能、產(chǎn)細(xì)菌素、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗氧化能力、降低膽固醇、產(chǎn)生相關(guān)酶類(lèi)等有益功能。

乳酸菌發(fā)酵食品是一種國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛(ài)的營(yíng)養(yǎng)保健食品。發(fā)酵大醬用的生產(chǎn)菌株是乳酸菌，大醬中含有較高濃度的鹽，在生產(chǎn)過(guò)程中乳酸菌的生長(zhǎng)會(huì)受到鹽濃度的影響而受到抑制。篩選出專(zhuān)用于發(fā)酵大醬的乳酸菌種對(duì)于在發(fā)酵大醬生產(chǎn)中縮短生產(chǎn)周期、提高食品安全性和穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量起著關(guān)鍵性的作用。

本實(shí)驗(yàn)旨在從農(nóng)家大醬中篩選出耐鹽性較好的乳酸菌菌株，并采用16S rDNA的方法對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，意在實(shí)現(xiàn)農(nóng)家大醬的安全化、工業(yè)化生產(chǎn)，并為構(gòu)建東北地區(qū)乳酸菌菌種資源庫(kù)做出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

農(nóng)家大醬:采自遼寧沈陽(yáng)、大連、撫順，本溪共15個(gè)樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑配制

MRS培養(yǎng)基配方:葡萄糖20.0 g/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L，牛肉浸膏8 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，蛋白胨8 g/L，吐溫·80 1 g/L，酵母粉4 g/L，檸檬酸鈉2 g/L，三水乙酸鈉5 g/L，K2HPO42 g/L，臨用前添加1%CaCO3，121℃高壓滅菌20 min。

10×TE緩沖液:1 mol/L Tris-HCl Buffer(PH:7.4、7.6、8.0)100 mL，0.5 mol/L 的 EDTA 20 mL(pH:8.0)，定容 1L，121℃、20 min 滅菌備用。

1 mol/L Tris-HCL(pH 8.0):稱(chēng)取121.1g Tris溶于800 mL無(wú)菌水中，加濃HCl調(diào)pH到8.0，定容至1L，高壓滅菌。

0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)186.1g EDTA-Na·2H2O溶于800 mL無(wú)菌水中，需用磁力攪拌器劇烈攪動(dòng)，用NaOH調(diào)pH值到8.0(約20g)，定容至1L，高壓滅菌。

10%SDS:稱(chēng)取SDS 10g于100～200 mL燒杯中，加80 mL雙蒸水中60℃加熱溶解，用 HCl調(diào) pH至7.2，定容至100 mL，室溫保存。滅菌10 mol/L CTAB(十六烷基三甲基溴化銨):10g CTAB溶于80 mL無(wú)菌水中，定容至100 mL，高壓滅菌。

0.7 mol/L NaCl:4.095 g NaCl溶于80 mL無(wú)菌水中，定容100 mL，高壓滅菌。

酚、氯仿、異戊醇:Tris-飽和酚從4℃冰箱中取出，上層為保護(hù)液，取下層黃色酚相使用。按比例與氯仿、異戊醇混合，放入4℃冰箱存放。

1.1.3 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng);UV-4802紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司;生物潔凈工作臺(tái)，蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司;Centrifuge 5418R小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，(德國(guó))Eppendorf;DNP-9080型生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋，上海精宏試驗(yàn)儀器有限公司;VS-1型渦旋儀，上海瀘西分析儀器廠(chǎng)有限公司;尼康生物顯微鏡，南京江南光電(集團(tuán))股份有限公司;ND-100型微量紫外分光光度計(jì)，上海美析儀器有限公司;DW-86L486型超低溫保存箱，青島海爾特種電器有限公司;CDS8000型UPV凝膠成像分析系統(tǒng)、PTC-200型梯度基因擴(kuò)增儀、電泳儀，美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)家大醬的采樣

將農(nóng)民家庭以傳統(tǒng)方法制作的大醬，在其發(fā)酵容器中充分?jǐn)嚢韬螅?0g左右大醬加入封口袋中封存，將收集的樣品放入提前準(zhǔn)備好的冰盒內(nèi)冷卻，間隔一段時(shí)間需要更換一次冰袋，使大醬保存在較低溫度狀態(tài)下帶回實(shí)驗(yàn)室，然后放入 -20℃冰箱凍存，盡快進(jìn)行乳酸菌的分離，防止菌體死亡。

1.2.2 乳酸菌的分離純化

稱(chēng)取1 g大醬樣品，加入含有10 mL生理鹽水的滅菌試管中，按照10倍梯度稀釋法稀釋大醬樣品至10-8g/mL。分別取 10-6g/mL、10-7g/mL、10-8g/mL 3個(gè)梯度樣品100 μL，采用涂布法將樣品接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿放入BBL厭氧培養(yǎng)罐中，在罐中加入保險(xiǎn)粉以除去氧氣。分別將培養(yǎng)罐置于20、30、37℃ 3個(gè)梯度的培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48h。待菌落形成后，用接種環(huán)挑取疑似乳酸菌菌落形態(tài)的單個(gè)菌落，接種于 MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。對(duì)菌體采用平板劃線(xiàn)法進(jìn)行純化，仔細(xì)觀察菌落形態(tài)以及革蘭氏染色后的細(xì)胞形態(tài)特征，在顯微鏡油鏡下挑選視野清晰且形態(tài)典型的菌體，進(jìn)行拍照記錄，并同時(shí)進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。凡是革蘭氏染色呈陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)為陰性的菌株，均暫定為乳酸菌，并進(jìn)一步培養(yǎng)穿刺保存。

1.2.3 耐鹽性乳酸菌篩選

將初步鑒定得到的疑似乳酸菌保存菌株用接種針挑去部分菌體，接種于5 mL已滅菌的MRS培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，作為活化1代菌。用移液槍吸取200 μL一代菌接種于5 mL已滅菌的MRS培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，作為活化2代菌。以此方法將菌株活化至3代，第3代培養(yǎng)12 h，此時(shí)菌株的活性最好。吸取混勻后的3代菌液100 μL分別加入 5 mL NaCl濃度分別為 4%、6%、8%、10%、14%、16%、20%的 MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)液用渦旋儀混勻后，以空白MRS液體培養(yǎng)基調(diào)零，在波長(zhǎng)600 nm處，測(cè)OD值。

1.2.4 乳酸菌的生理生化鑒定

取革蘭氏陽(yáng)性和過(guò)氧化氫酶陰性菌落按照東秀珠、蔡妙英［5］的常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)方法，對(duì)菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。

1.2.5 分離株的保存

采用真空冷凍干燥法［6］對(duì)菌體進(jìn)行凍干保存。

1.2.6 供試菌液的制備

將采用真空冷凍干燥法凍干保存的菌種，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，活化3代。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢確定為純菌后，取第3代MRS液體培養(yǎng)物，12 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，在沉淀中加入5 mL滅菌生理鹽水，12 000 r/min、10 min(4℃)離心洗滌菌體，重復(fù)離心洗滌菌體2次。最后加入5 mL滅菌生理鹽水，用渦旋儀振蕩混勻，即為供試菌液。

1.2.7 總DNA的提取

采用優(yōu)化后的CTAB法［7］提取DNA。

1.2.8 乳酸菌基因組DNA純度檢測(cè)

分別取1 μL上述制備的乳酸菌基因組DNA原液，用ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)乳酸菌基因組DNA的濃度以及在吸光度為260、280時(shí)的OD值。

1.3 PCR擴(kuò)增

1.3.1 擴(kuò)增引物

16S rDNA擴(kuò)增引物采用通用引物［8-9］，正向引物為27f(對(duì)應(yīng)于Escherichia coli 8-27位堿基):5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物為 1495r(對(duì)應(yīng)于 Escherichia coli 1495-1515位堿基):5'-GGCTGCTGGCACGTAGTTAG-3'，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增片段約為1 500 bp。

1.3.2 擴(kuò)增體系以及循環(huán)參數(shù)

將上述制備的基因組 DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，采用20μL反應(yīng)體系(表1)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)條件為:95℃ 預(yù)變性5 min;95℃ 變性30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 1 min 30 s，循環(huán) 24次;72℃ 末端延伸10 min;10℃ 保溫。

1.3.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè)

預(yù)先制備1.0%的瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)，擴(kuò)增反應(yīng)完畢后，取5 μL的 PCR產(chǎn)物與 1μL Loading buffer混合，將樣品加樣于瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中進(jìn)行電泳，電壓5 V/cm，電泳液為1×TAE。大約20 min后，電泳結(jié)束，紫外燈下觀察。如果 PCR成功，則可見(jiàn)到約為1 500 bp的條帶。

1.3.4 16S rDNA序列測(cè)定及分析

將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物用保溫盒(內(nèi)含冰袋)寄到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序，測(cè)得菌株16S rDNA基因序列后，將基因序列在NCBI上使用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，同時(shí)從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)，并用MAGE軟件包以Neighbor Join法制作系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［10］。

表1 PCR擴(kuò)增體系Table 1 PCR amplification system

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)家大醬中乳酸菌的初步鑒定

2.1.1 農(nóng)家大醬篩選后的菌落形態(tài)觀察結(jié)果

從15個(gè)樣品中分離獲得典型的菌株62株，從沈陽(yáng)大醬樣品中篩選出14株菌株，按照大醬采集地編號(hào)為SY1～SY14;從大連大醬樣品中篩選出16株菌株，按照大醬采集地編號(hào)為DL1～DL16;從撫順大醬樣品中篩選出15株菌株，按照大醬采集地編號(hào)為FS1～FS15;從本溪大醬樣品中篩選出17株菌株，按照大醬采集地編號(hào)為BX1～BX14。菌株在MRS固體培養(yǎng)基上，為白色或乳白色，圓形菌落，表面光滑有光澤，中間凸起，邊緣整齊，如圖1所示。

圖1 5株乳酸菌菌落形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Colony morphological characteristics of 5 LAB strains

2.1.2 農(nóng)家大醬中乳酸菌初步鑒定結(jié)果

對(duì)從農(nóng)家大醬中分離得到的62株疑似乳酸菌菌株進(jìn)行純化，對(duì)純化后菌株進(jìn)行革蘭氏染色。顯微鏡油鏡下觀察顯示，在這些菌株中有革蘭氏陽(yáng)性菌36株，包括球狀菌株16株，桿狀菌株20株。結(jié)果如圖2所示。

圖2 5株乳酸菌株的革蘭氏染色菌體形態(tài)Fig.2 Morphology after gram stain of 5 LAB strains

對(duì)36株革蘭氏陽(yáng)性菌進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)10株疑似乳酸菌呈陽(yáng)性反應(yīng)，另外有26株為陰性反應(yīng)。通過(guò)革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)從62株疑似乳酸菌株中獲得革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性的菌株26株，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 從農(nóng)家大醬中分離得到的菌株初步鑒定結(jié)果Table 2 Preliminary identification result of the isolated strains from soybean paste

2.1.3 耐鹽性乳酸菌的篩選

在大醬發(fā)酵過(guò)程中，NaCl含量在8%左右。高濃度的NaCl能夠抑制某些致病和腐敗微生物的生長(zhǎng)繁殖，但也會(huì)對(duì)乳酸菌的代謝活動(dòng)產(chǎn)生影響［11］。乳酸菌的生長(zhǎng)受到抑制，對(duì)最終大醬質(zhì)量有很大影響，所以耐鹽的乳酸菌對(duì)大醬品質(zhì)的好壞起著決定性作用［12］。文中對(duì)篩選出的26株疑似乳酸菌在不同 鹽濃度的MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況進(jìn)行研究分析，同時(shí)以吸光值變化作為菌株的生長(zhǎng)指標(biāo)，研究其對(duì)不同 NaCl濃度的耐受能力，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 26株乳酸菌株在不同NaCl濃度下生長(zhǎng)情況Table 3 Growth situation of 26 LAB strains under different concentration of NaCl

由表3中數(shù)據(jù)可以看出，隨著培養(yǎng)基中 NaCl濃度不斷升高，26株乳酸菌的OD600值在逐漸變小。在NaCl濃度為4% 的MRS培養(yǎng)基中，26株乳酸菌基本不受影響，生長(zhǎng)狀況良好，OD600值在 0.921～2.176之間;NaCl濃度為6%的MRS培養(yǎng)基中，部分菌株生長(zhǎng)狀況受到影響，OD600值在0.312～1.584之間;當(dāng)NaCl濃度上升到8%時(shí)，大部分乳酸菌的生長(zhǎng)受到了抑制，其中菌株 SY1-1、SY3-5、SY4-2、DL3-1、DL3-6、DL4-5、FS1-11、FS2-3、FS5-5 的 OD600值相對(duì)較高，表明這7株菌有一定的耐受能力;當(dāng) NaCl濃度為10%時(shí)，只有菌株 SY4-2、DL3-1、DL4-5、FS1-11、FS5-5的 OD600值在0.195以上，依然可以生長(zhǎng);當(dāng) NaCl濃度增加到12%時(shí)26株乳酸菌OD600值降低較為明顯，菌株 SY4-2、DL3-1、DL4-5、FS1-11、FS5-5 的 OD600值在0.100左右;當(dāng) NaCl濃度上升到14% ～20%時(shí)，26株乳酸菌生長(zhǎng) OD600值一直維持在0.030～0.060之間，考慮到接種的影響，我們可以初步斷定26株菌幾乎不生長(zhǎng)。因此，篩選得到5株具有較高耐鹽能力的乳酸菌，即菌株 SY4-2、DL3-1、DL4-5、FS1-11、FS5-5，這5株菌的耐鹽濃度可以達(dá)到12%左右。

2.1.4 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)篩選出的5株疑似乳酸菌菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 5株乳酸菌的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of 5 LAB strains

注:“+”為陽(yáng)性反應(yīng);“-”為陰性反應(yīng);“(+)”為弱陽(yáng)性反應(yīng);“(-)”為弱陰性反應(yīng)。

綜上所述，根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征并參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版［13］，對(duì)5株乳酸菌的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明，菌株 DL3-1、DL4-5、FS5-5均屬于乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)，菌株SY4-2、FS1-12屬于腸球菌屬(Enterococcus sp.)。

2.2 16S rDNA基因序列同源性分析結(jié)果

2.2.1 乳酸菌基因組DNA提取結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中采用優(yōu)化后的CTAB法提取供試菌株基因組DNA，分別用ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度及含量。基因組DNA檢測(cè)結(jié)果如表5所示。

表5 基因組DNA檢測(cè)結(jié)果Table 5 Genome DNA test results

從表5得知，CTAB法提取的基因組DNA濃度最低的是 FS5-5，為 241.5 ng/μL，最高為 SY4-2，為423.5 ng/μL。OD260/OD280值均在1.70附近。說(shuō)明基因組DNA受到微量蛋白質(zhì)或酚類(lèi)物質(zhì)的影像，但是能滿(mǎn)足后續(xù)16S rDNA擴(kuò)增和測(cè)序的需要。

2.2.2 16S rDNA區(qū)域PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠，對(duì)5株供試菌株的基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，通過(guò)凝膠成像分析系統(tǒng)得到5株菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳圖，如圖3所示。

從圖3看出，在約1 500 bp處出現(xiàn)熒光條帶，2號(hào)菌的條帶稍暗，但并不影響結(jié)果。說(shuō)明PCR擴(kuò)增成功，能滿(mǎn)足后續(xù)16S rDNA測(cè)序的需要。

圖3 16S rDNA PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis map of 16S rDNA amplification products

2.2.3 測(cè)序結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增成功的DNA樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得16S rDNA基因序列分析顯示，菌株SY4-2的16S rDNA基因序列長(zhǎng)度有1 379bp核苷酸;菌株DL3-1的16S rDNA基因序列長(zhǎng)度有1 417bp核苷酸;菌株DL4-5的16S rDNA基因序列長(zhǎng)度有1 419bp核苷酸;菌株FS1-11的16S rDNA基因序列長(zhǎng)度有1 413bp核苷酸;菌株FS5-5的16S rDNA基因序列長(zhǎng)度有1 432bp核苷酸。將測(cè)序獲得的基因序列與NCBI中相關(guān)乳酸菌菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性分析，并用MEGA軟件以Neighbor Join法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［14］。結(jié)果如圖4所示。

如圖4所示，從總體上可將這10株乳桿菌分為兩大群，即 FS5-5、Lactobacillus plantarum YML007、Lactobacillus plantarum IMAU32388、DL4-5、DL3-1 和Lactobacillus plantarum P10為第一群，其余乳桿菌菌株組成第二群。第一群中，菌株FS5-5、DL4-5、DL3-1與 Lactobacillus plantarum YML007、Lactobacillus plantarum IMAU32388處于同一分支，同源性較高。在第二群中，菌株FS1-11與所在分支的Enterococcus faecium S4-4系統(tǒng)位置最近，同源性可以達(dá)到99%，還有Enterococcus faecium和SY4-2與其在同一分支。綜上所述，我們可以鑒定菌株DL3-1、DL4-5、FS5-5為植物乳桿菌，SY4-2、FS1-12為屎腸球菌。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)微生物的分離培養(yǎng)方法對(duì)農(nóng)家大醬中的乳酸菌進(jìn)行了分離。利用NaCl作為外界脅迫條件，對(duì)篩選出的乳酸菌進(jìn)行耐鹽性實(shí)驗(yàn)，挑選出5株耐鹽性較好的菌株。對(duì)這5株菌提取DNA，并通過(guò)PCR技術(shù)將其擴(kuò)增，采用16S rDNA技術(shù)對(duì)這5株菌進(jìn)行鑒定。

圖4 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain

(1)從15個(gè)樣品中分離獲得典型的菌株62株，菌株在MRS固體培養(yǎng)基上，為白色或乳白色，圓形菌落，表面光滑有光澤，中間凸起，邊緣整齊。通過(guò)革蘭氏染色與過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，從62株疑似乳酸菌的菌株中篩選出革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性的乳酸菌菌株26株。

(2)利用NaCl作為外界脅迫條件，當(dāng) NaCl濃度增加到 12%時(shí)，菌株 SY4-2、DL3-1、DL4-5、FS1-11、FS5-5的 OD600值在0.100左右。與其他菌株相比，這5株菌具有較好的耐鹽特性。耐鹽濃度可以達(dá)到12%左右。對(duì)耐鹽性較好的5株菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征并參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版［13］，對(duì)5株乳酸菌的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明，菌株 DL3-1、DL4-5、FS5-5均屬于乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)，菌株 SY4-2、FS1-12屬于腸球菌屬(Enterococcus sp.)。

(3)對(duì)這5株菌提取DNA并經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，最后采用16S rDNA的方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示5株菌中，DL3-1、DL4-5、FS5-5 為植物乳桿菌，SY4-2、FS1-11為屎腸球菌。

3.2 討論

大醬作為東北地區(qū)典型的發(fā)酵性食品而受到人們的歡迎。隨著科技的發(fā)展，工業(yè)化生產(chǎn)的市售大醬進(jìn)入人們的視野，但是，人們還是喜歡自家手工制作的農(nóng)家大醬，因?yàn)槠渲杏刑厥獾奈兜馈９I(yè)化生產(chǎn)的市售大醬由于需要滅菌而使大醬中的微生物含量較少，本實(shí)驗(yàn)采用農(nóng)家大醬作為原材料也是出于這方面原因。大醬中含NaCl濃度大約8%左右，乳酸菌長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)在鹽濃度下會(huì)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，從而使自己更有利的存活下去，這樣乳酸菌會(huì)對(duì)NaCl具有一定程度的耐受性，也更有利于篩選出耐鹽性較好的乳酸菌。在大醬的發(fā)酵過(guò)程中，耐鹽性較好的乳酸菌會(huì)更適應(yīng)大醬中的鹽環(huán)境，從而更好地生長(zhǎng)，可以大大縮短大醬的生產(chǎn)周期，穩(wěn)定產(chǎn)品的質(zhì)量。

對(duì)于基因組的提取，目前采用較多的2種方法為試劑盒法與CTAB法。試劑盒法提取基因組DNA，DNA濃度和純度較高，提取效率高，可直接用于PCR擴(kuò)增、測(cè)序等，但造價(jià)相對(duì)昂貴些，適用于少量DNA樣品的提取。CTAB法提取基因組DNA，出于安全等多方面因素的考慮，可能在一定程度上影響提取DNA的純度以及穩(wěn)定性而使DNA中含有少量的蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)，但是不會(huì)影響后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行，而且此方法造價(jià)低，能滿(mǎn)足一般分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的需要。為了更好地獲得DNA，一方面考慮盡量去除雜質(zhì)、蛋白和脂類(lèi)，CTAB在高離子強(qiáng)度的溶液中可以與蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)結(jié)合，而不與DNA結(jié)合，這里還可以添加一些還原劑比如β-巰基乙醇來(lái)避免褐化物質(zhì)對(duì)DNA的影響;另一方面考慮加強(qiáng)DNA的沉淀效果，氯仿-異戊醇可以進(jìn)一步使蛋白質(zhì)變性分層并去除脂類(lèi)，最后用低溫預(yù)冷的無(wú)水乙醇或者異戊醇來(lái)沉淀DNA。

本文從農(nóng)家大醬中獲得了耐鹽性較好的乳酸菌菌株，但應(yīng)用菌株對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的提升還需深入研究。下一步工作應(yīng)該圍繞著應(yīng)用耐鹽乳酸菌的發(fā)酵性能來(lái)改善農(nóng)家大醬產(chǎn)品品質(zhì)。同時(shí)耐鹽性乳酸菌之所以能夠耐鹽，它的耐鹽機(jī)理是什么也是要研究的重點(diǎn)。乳酸菌作為益生菌的最大群體，其分布較為廣泛，性能優(yōu)良的乳酸菌更是人們所需要的。它不僅可以提高食品的品質(zhì)，而且可以促進(jìn)人體健康，為人類(lèi)做出貢獻(xiàn)。

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