不同蛋白酶的豬、兔骨酶解液對小鼠脾淋巴細胞增殖作用的比較

曾 珍， 李 誠， 付 剛， 蘇 趙， 楊 勇， 何 利， 胡 濱

（四川農業大學 食品學院，四川 雅安 625014）

我國是各類動物骨生產的大國，據統計每年約有2 183萬t的各類動物骨骼產生[1]，但絕大多數骨頭都沒有得到充分利用。骨頭含有大量的骨膠原蛋白，這些蛋白質所含氨基酸種類較為豐富[2]，是一種良好的蛋白源。近年來針對動物骨的利用開發引起了科研人員的關注，特別是通過水解動物骨獲得功能肽成為了研究的熱點。趙玲等人從鱈魚骨里提取出具有抗氧化作用的膠原蛋白肽[3]。Saiga等人也從雞腿骨里提取出了具有抗高血壓活性的多肽，其氨基酸序列為Gly-Ala-Hyp-Gly-Leu-Hyp-Gly-Pro，且其活性較高（IC50=29 mmoL/L）[4]。YANG Hua等人用木瓜蛋白酶從羊骨里提取出免疫活性肽[5]。免疫活性肽通常被認為是一種能夠增強機體免疫力[6]、增強巨噬細胞吞噬功能[7]、提高機體抵御外界病原體感染能力[8]，因其相對分子質量低、活性強、用量少、穩定性強、生物活性高的獨特優勢受到了人們的重視。作者采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和Alcalase堿性蛋白酶分別水解豬骨、兔骨，研究各水解產物的對小鼠脾淋巴細胞增殖活性，為利用豬、兔骨制備免疫活性肽提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮豬骨（豬后腿股骨頭）、兔骨（除頭骨以外的全身骨骼）：市售；昆明種小鼠：5周齡，體重18 g，雌性，由四川農業大學獸醫院提供；胰蛋白酶（7.8×104U/g）、木瓜蛋白酶（13×104U/g）：廣西南寧龐博生物有限公司；Alcalase 堿性蛋白酶（11.5×104U/g）：丹麥NOVO公司；其它試劑：均為分析純。

1.2 主要儀器

BR4i型多功能冷凍離心機：法國THERMO JOUAN公司；iMark酶聯免疫檢測儀：美國伯樂公司；311型CO2培養箱：美國Thermo Scientific公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：金壇市富華儀器有限公司；PHS-3C酸度計：方舟科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶解工藝流程 豬、兔骨（剔凈殘肉、皮、腱、軟骨及其它非骨骼成分）→宰碎至5～6 cm→脫脂（1∶1 甲醛/氯仿 37 ℃，浸泡 24 h）[9]→蒸餾水清洗（除去殘渣）→高壓蒸煮2 h（0.1 MPa，121℃）→常溫干燥→粉碎→過篩（80目）→加入100 mL蒸餾水→混勻→預處理（90℃熱處理10 min）→冷卻至常溫→調節pH到指定值→加入一定量的酶在指定溫度下酶解指定的時間→滅酶 （100℃、10 min）→離心過濾（8 000 g 20 min），取上清液測定脾淋巴細胞增殖率。

1.3.2 豬、兔骨酶解工藝參數的單因素實驗

1）底物濃度對酶解效果的影響：用胰蛋白酶（溫度50℃、pH 8、酶底比5 000 U/g、水解時間4 h）、木瓜蛋白酶（pH 7、酶底比 5 000 U/g、水解時間4 h，水解溫度60℃）和Alcalase堿性蛋白酶（pH 9、酶底比6 000 U/g、水解時間2 h、溫度55℃）酶解不同底物蛋白質量分數2%、4%、6%、8%、10%的豬、兔骨，測定其對小鼠脾淋巴細胞增殖率。

2）溫度對酶解效果的影響：以小鼠脾淋巴細胞增殖率為指標，在豬、兔骨底物蛋白質量分數6%、pH 8、酶底比5 000 U/g、水解時間4 h的條件下研究不同水解溫度 30、40、50、60、70 ℃對胰蛋白酶酶解效果的影響；在豬、兔骨底物蛋白質量分數6%、pH 7、酶底比5 000 U/g、水解時間4 h條件下，研究不同水解溫度 50、55、 60、65、70 ℃對木瓜蛋白酶酶解效果的影響；在豬、兔骨底物蛋白質量分數6%、pH 9、酶底比6 000 U/g、水解時間 2 h下研究40、45、50、55、60 ℃對 Alcalase 堿性蛋白酶酶解效果的影響。

3）pH值對酶解效果的影響：以小鼠脾淋巴細胞增殖率為指標，在豬、兔骨底物蛋白質量分數6%、水解溫度50℃、酶底比5 000 U/g、水解時間4 h條件下，研究pH 7、7.5、8、8.5對胰蛋白酶酶解效果的影響；在豬、兔骨底物蛋白質量分數6%、水解溫度60℃、酶底比5 000 U/g、水解時間5 h條件下，研究不同 pH 5、5.5、6、6.5、7 對木瓜蛋白酶酶解效果的影響；在豬、兔骨底物蛋白質量分數6%、水解溫度50℃、酶底比6 000 U/g、水解時間2 h條件下研究 pH 8、8.5、9、9.5、10 對 Alcalase 堿性蛋白酶酶解效果影響。

4）酶與底物蛋白濃度比對酶解效果的影響：以小鼠脾淋巴細胞增殖率為指標，在豬、兔骨底物蛋白質量濃度6%、水解溫度50℃、pH 8、水解時間4 h條件下，研究不同酶底比 4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 U/g對胰蛋白酶酶解效果的影響；在豬、兔骨底物蛋白質量分數6%、水解溫度60℃、pH 7、水解時間4 h條件下，研究不同酶底比4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 U/g 對木瓜蛋白酶酶解效果的影響；在豬、兔骨底物蛋白質量分數6%、水解溫度50℃、pH 9、水解時間2 h的條件下研究不同的酶與底物比 2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g對Alcalase堿性蛋白酶酶解效果的影響。

5）時間對酶解效果的影響：以小鼠脾淋巴細胞增殖率為指標，在豬、兔骨底物蛋白質量分數6%，pH 8，溫度50℃，酶底比5 000 U/g條件下，研究不同水解時間 3、4、5、6、7 h 對胰蛋白酶酶解效果的影響。在豬、兔骨底物蛋白質量分數6%，pH 7，溫度60℃，酶底比5 000 U/g條件下，研究不同水解時間2、3、4、5、6 h對木瓜蛋白酶酶解效果的影響；在豬、兔骨底物蛋白質量分數6%，pH 9，溫度50℃，酶底比 6 000 U/g 條件下研究不同酶解時間 2、3、4、5、6 h對Alcalase堿性蛋白酶酶解效果的影響。

1.3.3 優化豬、兔骨酶解工藝參數的正交實驗 根據單因素實驗結果確定酶解的底物蛋白質量分數為6%，選用Alcalase堿性蛋白酶水解豬骨，選用木瓜蛋白酶水解兔骨，選擇水解溫度（℃）、pH值、水解時間（h）、酶/底物（U/g）作為實驗因子，采用 L9（34）正交實驗設計。以脾淋巴細胞增殖率為主要指標，確定蛋白酶酶解豬、兔骨蛋白的最佳工藝參數。

1.3.4 檢測方法

1）酶活性測定：福林酚法SB/T 10317-1999。

2）蛋白質的測定：凱氏定氮法（GB5009.5—2010）。

3）水解度的測定：采用雙指示劑甲醛滴定法[10]。

4）無菌小鼠脾淋巴細胞制備：小鼠禁食12 h，摘眼球放血后脫頸處死，浸泡在75%的乙醇中3～5 min，于超凈工作臺上無菌打開腹腔，取出小鼠脾臟置于含有無菌Hanks液的平皿中，去除外周結締組織，并用無菌Hanks液清洗脾臟，去除血液。用無菌注射器芯擠壓研磨，制成細胞懸液。用Hanks液洗3次，然后于1 500 r／min離心8 min，棄上清液。然后將細胞懸浮于2 mL的RPMI 1640完全培養液中。調整細胞濃度為 2.0×106個 ／mL[11-12]。

5）MTT法測定脾淋巴細胞增殖：設實驗組和對照組。在96孔板中每孔加入已制備好的小鼠脾細胞懸液100 μL。對照組加入RPMI 1640完全培養液 100 μL，實驗組加入 100 μL 酶解液，置于 37℃下5%CO2培養箱中培養68 h，再加入MTT 50 μL，4 h培養結束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。室溫下放置15 min后，用酶聯免疫檢測儀，于570 nm波長測定光密度值[13]。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 底物蛋白質量濃度對酶解效果的影響 由圖1可知，隨著底物蛋白質量分數的增加，酶解液的脾細胞增殖率也在升高，在6%時脾細胞增殖率達到最高，而后脾細胞增殖率開始下降。因此6%為最適的底物濃度。

圖1 底物蛋白濃度對脾淋巴細胞增殖率的影響Fig.1 Effect of Substrate concentration on proliferative activity of spleen cells

2.1.2 溫度對酶解效果的影響 由圖2可知，隨著溫度的升高，酶解液的脾細胞增殖活性呈先升高后下降的趨勢。胰蛋白酶最適溫度范圍為50～60℃，木瓜蛋白酶的最適溫度范圍為55～65℃，Alcalase堿性蛋白酶最適溫度為45～55℃。

2.1.3 pH值對酶解效果的影響 由圖3可知，隨著pH值的升高，酶解液的脾細胞增殖活性呈先升高后下降的趨勢。胰蛋白酶最適pH值范圍為7.5～8，木瓜蛋白酶的最適pH至范圍為5.5～65，Alcalase堿性蛋白酶最適pH值范圍為8.5～9.5。

圖2 溫度對脾淋巴細胞增殖率的影響Fig.2 Effect of temperature on proliferative activity of spleen cells

圖3 pH值對脾淋巴細胞增殖率的影響Fig.3 Effect of pH on proliferative activity of spleen cells

2.1.4 酶與底物蛋白濃度比對酶解效果的影響由圖4可知，隨著酶底比的升高酶解液的脾細胞增殖活性呈先升高后下降的趨勢。胰蛋白酶最適酶底比范圍為6 000～7 000 U/g，木瓜蛋白酶的最適酶底比范圍為5 000～7 000 U/g，Alcalase堿性蛋白酶最適酶底比范圍為4 000～8 000 U/g。

2.1.5 時間對酶解效果的影響 由圖5可知，隨著水解時間的增加酶解液的脾細胞增殖活性呈先升高后下降的趨勢。胰蛋白酶最適水解時間比范圍為4～5 h，木瓜蛋白酶的最適水解時間范圍為3～5 h，Alcalase堿性蛋白酶最適水解時間范圍為3～5 h。

圖4 酶底比對脾淋巴細胞增殖率的影響Fig.4 Effect of E/S on proliferative activity of spleen cells

圖5 水解時間比對脾淋巴細胞增殖率的影響Fig.5 Effect of time on proliferative activity of spleen cells

2.2 Alcalase堿性蛋白酶酶解豬骨實驗結果

由單因素實驗結果可知，三種蛋白酶酶解兔骨產物對小鼠脾細胞增殖作用的強弱為：木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞Alcalase堿性蛋白酶，因此選用木瓜蛋白酶作為酶解兔骨正交實驗的使用酶。

由表1和表2分析知，在Alcalase堿性蛋白酶酶解豬骨正交實驗中，酶與底物比、溫度、pH、時間四個因素對脾細胞增殖率的影響順序為：酶與底物比＞pH＞時間＞溫度，其中pH、酶與底物比的影響顯著（P＜0.05），最優組合為：時間 4 h、pH 9.5、酶與底物比6 000 U/g、溫度45℃。通過對兩個指標的極差和方差分析，選擇脾細胞增殖能力的最優組合為最佳組合，即利用Alcalase堿性蛋白酶酶解豬骨的最佳反應條件為：時間4 h、pH 9.5、酶與底物比6 000 U/g、溫度45℃、底物質量分數6%。驗證實驗測得在最佳條件下酶解液的水解度為16.82%，脾細胞增殖率為83.41%。

表1 Alcalase堿性蛋白酶酶解正交實驗結果及分析Table 1 Results and analysis of alcalase orthogonal test

表2 Alcalase蛋白酶方差分析表Table 2 Analysis of variance from alcalase orthogonal test

2.3 木瓜蛋白酶酶解兔骨實驗結果

由單因素實驗結果可知，而三種蛋白酶酶解豬骨產物對小鼠脾細胞增殖作用的強弱為：Alcalase堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶。因此Alcalase堿性蛋白酶作為酶解豬骨正交實驗的使用酶。

由表3和表4分析知，在木瓜蛋白酶酶解兔骨正交實驗中，酶與底物比、溫度、pH、時間四個因素的對對脾細胞增殖率的影響順序為：時間＞溫度＞酶與底物比＞pH，其中時間和溫度的影響顯著 （P＜0.05），最優組合為：時間 4 h、pH 5.5、酶與底物比7 000 U/g、溫度65℃。通過對兩個指標的極差和方差分析，選擇脾細胞增殖能力的最優組合為最佳組合，即利用木瓜蛋白酶酶解兔骨的最佳反應條件為時間4 h、pH 5.5、酶與底物比 7 000 U/g、溫度 65 ℃、底物質量分數6%。驗證實驗測得在最佳條件下酶解液的水解度為16.25%，脾細胞增殖率為80.70%。

表3 木瓜蛋白酶酶解正交實驗結果及分析Table 3 Results and analysis of Papain orthogonal test

表4 木瓜蛋白酶方差分析表Table 4 Analysis of variance from papain orthogonal test

2.4 水解度對小鼠脾淋巴細胞增殖率的影響

圖6為木瓜酶解兔骨產物和Alcalase堿性蛋白酶酶解豬骨產物的水解度對脾細胞增殖活性的影響。在Alcalase堿性蛋白酶酶解條件下，隨著DH的增加，脾細胞增殖率呈先增加后減小的趨勢。水解度在15%～18%時，酶解液對小鼠脾淋巴細胞增殖率最高。而在木瓜蛋白酶酶酶解條件下，隨著DH的增加，脾細胞增殖率也呈增加的趨勢，但水解度均沒有超過17%。

圖6 水解度對脾細胞增殖活性的影響Fig.6 Effects of degree of hydrolysis on proliferative activity of spleen cells

3 結語

蛋白質中包含有許多生物活性序列，其中包括多種免疫活性肽，這些生物活性肽，均以無活性的形式存在于蛋白前體物中，只有用適當的蛋白酶水解并從蛋白中釋放出來后，才能成為具有生理活性的肽段[14]。用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和Alcalase堿性蛋白酶分別酶解豬、兔骨，得到的酶解液對小鼠脾淋巴細胞均有增殖作用，這是因為水解物能誘導細胞因子的釋放，這些細胞因子能夠激活免疫細胞產生免疫應答[15]。蛋白酶對水解的肽鍵具有專一性，所以不同蛋白酶對不同底物的作用結果不同[16]。胰蛋白酶酶解底物的脾細胞增殖活性強弱為：兔骨＞豬骨；木瓜蛋白酶酶解酶解底物的脾細胞增殖活性強弱為：兔骨＞豬骨；Alcalase堿性蛋白酶酶解底物的脾細胞增殖活性強弱為：豬骨＞兔骨。經過正交實驗可知，在豬骨最佳水解條件下得到的小鼠脾細胞增殖率為83.41%，略高于在兔骨最佳水解條件下得到的小鼠脾細胞增殖率80.70%。由實驗結果可以看出，水解度對免疫活性影響顯著。隨著DH的增加，脾細胞增殖率呈先增加后減小的趨勢。這可能是因為隨著酶解程度的提高，酶解物中有活性的短肽被分解成氨基酸或其活性基團被破壞，從而導致產物活性下降[7]。因此水解度在15%～18%時，酶解液對小鼠脾淋巴細胞增殖率最高。Hou和Kong等研究發現，水解度以及影響水解度的各因素如加酶量、底物質量濃度、pH、溫度等，對酶解鱈魚骨架和大豆蛋白質得到的多肽的體外免疫活性有顯著影響[17-18]。

研究結果表明，酶解豬骨的最佳酶為Alcalase堿性蛋白酶，其最佳條件為時間4 h、pH 9.5、酶與底物比6 000 U/g、溫度45℃、底物質量分數6%，其小鼠脾細胞增殖率為83.41%；酶解兔骨的最佳酶為木瓜蛋白酶，其最佳條件為時間4 h、pH 5.5、酶與底物比7 000 U/g、溫度65℃、底物質量分數6%，其小鼠脾細胞增殖率為80.70%。

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