榆干離褶傘發酵液對血管內皮細胞的保護作用

彭 瀛， 周廣亮， 沈明花

（延邊大學 醫學院，吉林 延吉 133000）

血管內皮細胞不僅作為血液與血管平滑肌之間的機械屏障，而且又是機體最大的內分泌器官[1]，在調節血管緊張度、抗血小板聚集以及抗凝促纖溶等過程中起著重要的作用，其抗栓作用越來越受到重視。血栓是血液中纖維蛋白多聚體與細胞組成的復合物，其形成與諸多因素有關，其中，血管內皮細胞的損傷與血栓形成密切相關。血管內皮細胞的過度凋亡是血栓形成的重要原因。

榆干離褶傘（Lyophyllum ulmarium），又名大榆蘑。屬擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、口蘑科、離褶傘屬。據文獻報道，其發酵液具有抗氧化[2]、溶栓[3]作用。作者主要探討榆干離褶傘發酵液對血管內皮細胞的保護作用，為榆干離褶傘的溶栓機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品的制備 榆干離褶傘菌種：由韓國益山大學特種作物加工實驗室提供。在25℃、150 r/min液體深層二級培養15 d。將發酵液用紗布過濾，收集濾液以3 000 r/min離心15 min，將上清液進行冷凍干燥，得樣品。

1.1.2 細胞株 人臍靜脈內皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）： 購自北京宏寶達生物科技有限公司

1.1.3 試劑 MTT和DMSO：Sigma公司；Annexin-V-Fluos試劑盒：美國Roche公司；DMEM培養基：Gibco公司；胎牛血清和胰酶：華美生物工程公司；兔抗 bcl-2、bax、Caspase-3 和 Caspase-9 抗體：美國Santa Cruz公司；LDH試劑盒：南京建成生物技術有限公司。

1.2 儀器

倒置顯微鏡：日本日立公司；酶標儀：日本島津公司；流式細胞儀：Beckman公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 將HUVEC在37℃、5%CO2條件下常規培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中。待細胞長滿至80%時更換為無血清培養基，做以下實驗并進行相應指標的測定。

1.3.2 MTT法檢測LU發酵液的細胞毒性作用 取對數生長期的細胞，將細胞密度調整為5×104/L，接種于96孔培養板，每孔200 μL。待細胞貼壁后，分4組，分別為空白對照組、低、中、高劑量LU發酵液用藥組，每組設6個復孔。用藥組分別加入終質量濃度為20、40、80 mg/L的LU發酵液，而空白對照組加相應體積的培養基。各組分別培養24、48 h后每孔加入預先配制的MTT液20 μL，37℃繼續孵育4 h。吸去每孔培養液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩5 min后，在波長490 nm處測定各孔光吸收值（A），按下列公式計算細胞存活率：

1.3.3 LU發酵液對H2O2所致損傷細胞存活率的影響 取前述傳代細胞接種到96孔板中，分為正常對照組、模型組和發酵液低（20 mg/L）、中（40 mg/L）、高（80 mg/L）劑量用藥組，每組設6個復孔。首先用藥組以低、中、高劑量發酵液預處理細胞24 h，正常對照組和模型組以無血清培養基代替。24 h后，除正常對照組外其余各組均加入終濃度為200 μmol/L的H2O2，繼續培養4 h后按方法1.3.2進行MTT檢測。

1.3.4 細胞上清液LDH的測定 收集各組上清液以測LDH活性。

1.3.5 流式細胞術測定細胞凋亡率 將細胞接種于6孔板，分組及處理同1.3.3。培養24 h后，用胰酶消化并收集細胞，用PBS沖洗兩次，調整細胞數1×106個。按美國Roche公司提供的試劑盒說明書操作，進行流式細胞儀凋亡檢測。

1.3.6 Western Blot法檢測 Bax、Bcl-2、Caspase-9和Caspase-3蛋白質的表達 分組及處理方法同1.3.3。分別收集各組細胞，提取總蛋白，參照文獻[4]方法進行電泳、轉膜、顯影及定影。

1.4 統計學分析

用SPSS統計軟件處理，進行單因素方差分析，數據用xˉ±s表示。

2 結果與分析

2.1 LU發酵液對正常血管內皮細胞的影響

與正常組相比，中、高劑量組處理HUVEC 24、48 h后細胞活力高于正常組，這就說明用藥劑量范圍內LU發酵液對正常內皮細胞無毒性作用，反而促進細胞的增殖，見表1。

2.2 LU發酵液對損傷細胞存活率及LDH的影響

如表2所示，模型組細胞存活率顯著低于正常組，LDH活性顯著高于正常組，說明H2O2作用以后損傷或死亡的內皮細胞數增多。用LU發酵液預處理以后，中、高劑量組細胞活力顯著高于模型組，且高劑量組的LDH活性顯著低于模型組，這就提示LU發酵液具有保護HUVEC的作用。

表1 LU發酵液對正常HUVEC存活率的影響Table 1 Effect of LU fermentation broth on survival rates of HUVECs

表2 LU發酵液對損傷細胞存活率及LDH的影響Table 2 Effect of LU fermentation broth on surviaval rates and LDH of cells with injury

2.3 LU發酵液對細胞凋亡的影響

圖1中A～E均為由四個象限組成的細胞直方圖，每個圖中左下象限代表正常細胞群（An-PI-），右下象限代表早期凋亡細胞群（An+PI-），右上象限代表晚期凋亡細胞和壞死細胞（An+PI+），左上象限代表為非特異死亡細胞（An-PI+）。與正常組相比，模型組凋亡率（47.24%）顯著增多，說明H2O2誘導的HUVEC凋亡模型制備成功。各劑量用藥組凋亡數明顯減少（p＜0.05），但無量效關系。

2.4 Bax、Bcl-2、Caspase-9 和 Caspase-3 蛋白質的表達結果

如圖2所示，與正常組比較，模型組Bax、Caspase-9和Caspase-3基因表達顯著增加，而Bcl-2基因表達變化不明顯。與模型組比較，各劑量用藥組Bax、Caspase-9和Caspase-3基因表達減少，而Bcl-2基因表達增多。

3 結語

圖1 LU發酵液對HUVEC細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of LU fermentation broth on apoptosis of HUVEC

MTT法常用于生物活性因子的活性檢測。本實驗中所用的劑量范圍內榆干離褶傘發酵液對HUVEC無細胞毒性，促進HUVEC的增殖。過氧化氫誘導HUVEC損傷后細胞存活率顯著下降，而用榆干離褶傘發酵液預處理時，其存活率明顯增高，這就提示榆干離褶傘發酵液對HUVEC的氧化損傷有保護作用。我們曾報道過榆干離褶傘發酵液的抗氧化作用[2]，由此可認為榆干離褶傘發酵液對HUVEC的保護作用與其抗氧化作用密切相關。當過氧化氫作用于HUVEC后，導致細胞的氧化損傷，由此細胞的完整性遭到破壞，引起細胞膜的通透性增加，導致細胞上清液LDH活性增加。以榆干離褶傘發酵液處理細胞后，因它對細胞有保護作用，所以用藥組細胞上清液的LDH活性明顯降低。

圖2 LU發酵液對Bax、Bcl-2、Caspase-9和 Caspase-3蛋白質的表達的影響Fig.2 Effect of LU fermentation broth on the protein expression of bcl-2,bax,caspase-3 and caspase-9

為了進一步探討榆干離褶傘發酵液對HUVEC的保護作用機制，用過氧化氫誘導細胞凋亡模型，觀察了榆干離褶傘對凋亡的影響。實驗結果顯示，模型組凋亡率47.24%，而用藥組凋亡率明顯下降，分別為18.1%、19.62%、13.47%，這就說明榆干離褶傘具有抑制凋亡的作用。在細胞凋亡調控的眾多基因中，Bcl-2和Bax是關鍵基因，其中BcI-2是凋亡抑制的基因，而Bax是凋亡促進基因。而當Bax在細胞內超表達時，Bax/Bax同源二聚體的數量明顯增多，細胞對死亡信號的反應性增強，啟動凋亡；而當Bcl-2高表達時，則Bax/Bax二聚體大量解離，生成更為穩定的Bcl-2/Bax異源二聚體，對抗其誘導凋亡的作用[5]。本實驗中，經過氧化氫誘導細胞凋亡后，模型組的Bax表達比正常組明顯增多；在用藥組中其表達量隨著劑量的增加逐漸減少，而Bcl-2的表達逐漸增多，這就提示榆干離褶傘發酵液可拮抗由過氧化氫引起的細胞凋亡。研究證實，H2O2主要通過激活經典的線粒體途徑誘導細胞凋亡[6]。在線粒體通路凋亡途徑中，當細胞受到過氧化氫等氧化應激刺激時，線粒體膜通透性增加，釋放出細胞色素 C，并與細胞凋亡激活因子 1（Apoptotic protease activating factor l，Apaf-）結合， 并活化Caspase-9的前體，進而激活Caspase-3，進而誘導細胞凋亡[7]。有文獻報道，Bax是在線粒體外膜通過形成離子通道方式促進細胞色素C等蛋白質分子釋放[8]。本實驗結果顯示，與正常組比較，模型組Caspase-9和Caspase-3明顯增加，表明過氧化氫通過影響Bax基因的表達，促進線粒體釋放大量的包括細胞色素C在內的蛋白質，誘導Caspase的激活。用榆干離褶傘發酵液預處理后，Bax/Bcl-2比值下降，Caspase-9和Caspase-3基因表達減少，這就提示榆干離褶傘發酵液可能通過抑制或阻斷線粒體凋亡通路，對血管內皮細胞起保護作用，而這種保護作用有可能作為它的溶栓作用機制之一。

[1]Pries A R，Kuebler W M.Normal endothelium[J].Handb Exp Pharmacol，2006，176（ptl）：1-40．

[2]孫權，沈玉秀，沈明花．榆干離褶傘發酵液體外抗氧化性能研究[J]．食品科技，2010，35（1）：223-225.SUN Quan，SHEN Yuxiu，SHEN Minghua.Study on the antioxidant activity of Lyophyllum ulmarium medea in vitro[J].Food Science and Technology，2010，35（1）：223-225.（in Chinese）

[3]沈明花，彭瀛，宋曉琳．榆干離褶傘發酵液的溶栓作用與降血脂作用研究[J]．食品與發酵工業，2011，37（10）：28-30.SHEN Minghua，PENG Ying，SONG Xiao-lin.Studies on fibrinolytic and hypolipidemic function of Lyophyllum ulmarium fermentation broth[J].Food and Fermentation Industries Editorial Staff，2011，37（10）：28-30.（in Chinese）

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