利用高通量測序分析云南豆豉中細菌群落多樣性

李曉然， 李 潔， 劉曉峰， 馮 陽， 柳陳堅

（昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明 650500）

發酵食品是指利用微生物加工制造而成的一類具有獨特風味與營養價值的食品，諸如酸奶、奶酪、泡菜、豆豉等。其中豆豉是以大豆或黃豆為主要原料，經由原料處理、制曲及后發酵三階段釀制而成，它不僅風味獨特，而且還富含多種生理活性物質，因此豆豉具有開胃增食、消積化滯、驅風散寒及預防心腦血管疾病等機能。豆豉品種繁多，根據發酵微生物的不同可以分為細菌型、曲霉型、毛霉型、根霉型和脈孢菌型等五大類[1]。由于云南省獨特的地理位置、氣候條件和民族文化傳統，生物資源繁多，細菌型豆豉中具有獨特和寶貴的菌種資源，由于缺乏對這些細菌全面的了解，這些寶貴的資源仍未得到很好的開發。

在傳統發酵食品中，通常采用富集純分離培養與鑒定方法對其中微生物群落結構進行研究，然而該方法不但操作繁瑣、費時費力，尤為重要的是在現有技術條件下，它僅能分離少數參與發酵的微生物，而大多數微生物得不到相應的分離培養與鑒定，通過純培養方法僅能得到傳統發酵樣品中微生物群落的極少部分信息，而不能真正反映傳統發酵食品中微生物群落的真實信息，從而給充分發掘與利用發酵食品中的微生物資源帶來一定困難。李祥研究了參與細菌型豆豉發酵的細菌群落，發現主要有豆豉芽孢桿菌 （Bacillus douchi）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、 乳酸桿菌 （Lactobacillus） 和微球菌（Micrococcus）[2]。基于 16S rRNA 基因克隆文庫或變性梯度凝膠電泳 （DGGE）能夠規避培養方法的弊端，使得對于樣品中的未培養細菌的分析成為可能。Chen等采用了PCR-DGGE的方法分析了豆豉中微生物群落結構，發現大多數豆豉中都檢測到了枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）、假單胞菌（Pseudomonas）、釀酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae）和粉狀畢赤酵母（Pichia farinose），同時也檢測到了潛在的病原微生物如葡萄球菌（Staphylococcus）、泛菌（Pantoea）和腸桿菌（Enterobacter）等[3]，暗示了在傳統發酵食品中潛在致病菌存在的廣泛性，因此使用分子生物學方法對其進行檢測是極為必要的。

隨著測序技術發展，被稱為“第二代測序（nextgeneration sequencing[NGS]）”技術在過去幾年中不斷涌現與發展。第二代測序技術的共同特點是：高通量、低成本、可以同時對多個單獨的DNA分子進行測序分析。基于Pyrosequencing[4-5]測序法一次能夠測定100萬個長度達到400 bp的核苷酸序列，其費用只相當于使用Sanger法測定幾千個序列的費用；由于該方法不需要克隆，可解決構建克隆文庫時所呈現的偏向性問題。2008年，Hamady等[6]展示一種同時可以平行分析多個樣品的焦磷酸測序法。在對不同樣品進行PCR擴增時，在引物5′末端添加由8個堿基組成的標記（bar-code），應用這種方法，在同一次測序反應中可以同時分析1 544個樣品。這一方法在多種類型樣品中的微生物多樣性及群落結構研究中得到極為廣泛應用。然而，該方法在傳統發酵食品中的應用還極為有限，僅有少數發酵食品使用該方法進行相應研究[7-8]。

作者通過高通量測序和序列分析，以期獲得云南細菌型豆豉中群落結構和多樣性，為進一步利用和開發豆豉中為細菌資源提供研究基礎，并為食品質量和安全提供一定信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集 試驗用豆豉：購于云南省玉溪市易門縣菜市場，為當地百姓手工制作。購買后置于冰盒中運送到實驗室，-80℃保存。

1.1.2 主要緩沖液 DNA提取裂解緩沖液：0.1 mol/L Tris/HCl，0.1 mol/L EDTA，0.75 mol/L 蔗糖。

1.2 方法與步驟

1.2.1 DNA提取 DNA提取參考Schmidt等[9]的方法并做了部分改變，步驟如下：取約0.2 g樣品置于無菌的2 mL離心管中，加入450 μL裂解緩沖液（0.1 mol/L Tris/HCl，0.1 mol/L EDTA，0.75 mol/L 蔗糖），加入 10 μL、50 mg/mL 溶菌酶（lysozyme）和 10 μL、20 mg/mL 溶壁酶（lyticase），避免劇烈振蕩，充分混合均勻后，37℃水浴30 min。加入25 μL 20%SDS和5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，避免劇烈振蕩，充分混合均勻后，55℃水浴2 h以上，加入0.1 g玻璃珠（直徑 212～300 μm，美國 SIGMA），于 labnet230 V EU渦旋儀（美國labnet）以最高轉速振蕩5 min，將管子放置于研缽中，加入液氮覆蓋，待液體全部凍住后放入55℃水浴鍋中融化，重復3次。加入80 μL 5 mol/L NaCl，小心混勻后，加入60 μL 10%CTAB/NaCl，小心混勻，65℃水浴20 min。加入700 μL 苯酚：氯仿：異戊醇（體積比 25∶24∶1），顛倒混勻后于4 000 r/min離心20 min，將上層水相轉移至新的2 mL離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1，體積比），顛倒混勻后于4 000 r/min離心20 min。將上層水相轉移至新的2 mL離心管中，加入0.6體積的異丙醇，-20℃沉淀過夜后于12 000 r/min離心15 min，倒掉液體，用500 μL預冷的70%乙醇洗沉淀，去掉液體后，將離心管打開蓋子，置于60℃烘干箱干燥，待液體全部揮發后取出，加入120 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0））緩沖液溶解DNA。提取好的DNA存放于-20℃。

1.2.2 細菌16S rRNA基因擴增和焦磷酸測序 使用細菌的16S rRNA基因通用引物對提取的DNA進行擴增。擴增使用通用引物338F（5’-ACH YCT ACG GGA GGC HGC-3’） 和 907R （5’-CCG TCA ATT CMT TTG AGT TT-3’），并在引物338F的5’末端添加8個堿基的標記和焦磷酸測序的AdapterA，在907R的5’末端添加AdapterB。為了減少PCR產物中非特異性擴增的異源雙鏈DNA的含量，將PCR產物稀釋10倍作為模版后按照原來的條件再做5個循環[10]。PCR擴增采用Premix Ex TaqTM（大連TaKaRa），具體體系及程序如下：

1）PCR 反應體系：ddH2O 18 μL；Forward 引物（5 μmol/L）2 μL；Reverse 引 物 （5 μmol/L）2 μL；Premix Ex TaqTM25 μL；模板（15 ng）3 μL；總體積50 μL。

2）PCR擴增程序：95℃預變性 5 min；94℃變性1 min；56℃退火1 min；共30個循環。72℃延伸1 min 30 s；72 ℃延伸 7 min。

將PCR產物在1 g/dL的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后將凝膠浸泡于含有20 μg/mL EB的TAE緩沖液中，10 min后在紫外燈（216 nm）照射下呈現橙色條帶，目標條帶割下后使用QIAquick Gel Extraction Kit（德國Qiangen）對PCR產物進行回收。使用nanodrop ND-1000分光光度計（美國Thermo）對完成純化的PCR擴增產物定量。使用GS-FLX（瑞士Roche）測序系統對DNA進行測序。

1.2.3 測序結果分類鑒定 對于焦磷酸測序的測序結果分析質量文件，去掉測序質量不好的序列，并對序列長度進行篩選，刪掉長度小于300 bp的序列，根據barcode將序列確定為本樣品的序列，并去除barcode和引物序列，得到有效的序列文件。使用Mallard v1.02[11]來檢測PCR產物序列中的嵌合體。使用mothur v1.25.1[12]的classify.seqs命令，采用Silva的核糖體小亞基（SSU）rRNA序列數據庫V102[13]的分類信息，得到序列的分類信息，分別采用80%的閾值（threshold）。

1.2.4 多樣性指數和系統發育分析 對所有序列使用mothur v1.25.1[12]進行比對，以0.03為cutoff值劃分可操作分類單元 （operational taxonomic unit，OTU）。計算cutoff為0.03時的ACE和Chao1值，并繪制rarefaction曲線。從細菌16S rRNA基因序列中每個OTU選取代表序列，將其在NCBI的GenBank進行Blast比對，將結果中具有確定分類信息的序列用ClustalX 1.83[14]進行比對，將比對的結果用Mega v4.0[15]中的Neighbour-joining方法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 序列數目和多樣性指數

經過對焦磷酸測序所得序列進行質量和長度刪選，得到356條高質量序列。對這些序列以0.03為cutoff進行分析，共得到62個OTU，其中，singleton42個，doubleton7個。 ACE值為 387，Chao1值為170，rarefaction曲線見圖1。可見OTU數目隨著序列數上升的趨勢還遠未達到平臺期。

圖1 根據rarefaction方法估計豆豉樣品的多樣性Fig.1 Estimated OTU numbers，according to the rarefaction method，depending on OTUs identified with a 3%cut-off

2.2 細菌群落多樣性分析

根據Silva的SSUrRNA序列數據庫對序列進行分類，在356條序列中，有91%（324條）的序列屬于厚壁菌門（Firmicutes），9%（32 條）的序列屬于變形菌門（Proteobacteria）。在厚壁菌門中，占總序列72%（258條）的序列屬于乳桿菌科（Lactobacillaceae），10%（36 條） 的序列屬于芽孢桿菌科（Bacillaceae），4%（15 條）的序列屬于肉桿菌科（Carnobacteriaceae）；在變形菌門中，所有的序列都屬于腸桿菌科 （Enterobacteriaceae），2%的序列不能確定分類信息（圖2（a））。在屬這一分類水平上，總序列的72%（256條）的序列都屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus），8%（28條） 的序列屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），而腸桿菌科的序列則大多屬于腸道菌簇（Enteric_Bacteria_cluster），3%的序列不能確定分類信息（圖 2b）。

圖2 豆豉中細菌在不同分類水平的分布Fig.2 Major families and genera in fermented soybean

2.3 系統發育分析

以0.03為cutoff，對356條序列進行序列比對和距離矩陣分析，確定了62個OTU，將其中的singleton和doubleton去除后，還有13個OTU，將其與GenBank數據庫中的序列進行比對，并下載相近序列共同構建系統發育樹，見圖3。豐度最高的OTU是YM_QT，占了總序列數的64%，經過比對，它與乳酸桿菌科的L.acidifarinae和L.zymae都有大于97%的相似度。豐度第二高的是OTU YM_DT，有11條序列，在系統發育樹上并未與已知分類信息的細菌呈現較高的相似度，但是可以確定分在芽孢桿菌屬中。有10條序列屬于OTU YM_P8，也屬于芽孢桿菌屬，與B.thermoamylovorans有98%的相似度。另有兩個OTU，YM_FM和YM_DP，均含有9條序列，雖然在系統發育樹上可以歸入乳酸桿菌屬，但是不能與已知分類信息的乳酸桿菌聚類在一起。在變形菌門中，有兩個OTU，其中YM_W2中有8條序列，與Erwinia persicina有99%以上的相似度，而YM_JS只有3條序列，與Shigella flexneri較為相似。雖然在屬的水平只有3%的序列不能確定分類信息，但是對于豐度較高的OTU，還是有約占總序列數10%的序列不能確定到種的水平。

3 結語

近年來，食品發酵中的微生物變化受到關注并得到了研究，科學家們通過rRNA基因序列分析的方法研究了如泡菜[16]、發酵的芥末醬[17]和發酵乳品[18]等世界各地不同的發酵食品的微生物群落多樣性，作者對云南特色的豆豉中細菌群落多樣性進行了研究，使用高通量焦磷酸測序技術，得到了356條序列，較為充分地展示了豆豉中細菌群落結構。通過多樣性指數和rarefaction曲線的結果可以看出，這一樣品細菌群落的多樣性是非常高的，因此，為了分析豆豉中的稀有群落（rare biosphere），使用高通量測序分析群落結構是必須的。在本研究中，約10%的序列不能確定具體的分類信息，有2%的序列甚至不能確定到科，這說明豆豉雖然為富營養環境，含有較多的可培養細菌，但是仍有一部分細菌為目前不能培養的細菌類型。

在他人的研究中，傳統豆豉的生產有很大的地域性差異，大多豆豉為真菌（霉菌）型豆豉[1]，而在本研究中，雖然對易門豆豉采用溶壁酶共同提取了真菌的DNA，在對真菌轉錄間隔區（ITS）序列擴增時則未得到相應條帶，因此，易門豆豉應該是以細菌起主要作用的細菌型豆豉。

在本研究分析的豆豉樣品中，大多數序列都集中在乳酸桿菌中，作為主要的乳酸菌種類，乳酸桿菌屬的細菌在多種發酵食品中檢測到并發揮重要作用。作為乳酸桿菌中豐度最高的OTU，YM_QT與L.acidifarinae和L.zymae都顯示了很高的相似度，這兩株菌都是從小麥酵母中分離到的[19]，也證明這兩株菌對于植物性底物的發酵具有較好的作用，是豆豉的生產過程中最為主要的細菌。豐度第二高的OTU為YM_P8，可認為是B.thermoamylovorans，這是一株中度嗜熱和淀粉的細菌[20]，在豆豉制作過程中也起著重要作用。這一結果與以往的研究認為細菌型豆豉以芽孢桿菌為主[1-2]并不相符，主要原因為：一方面，由于以前的研究大多是采用培養的方法，這使得芽孢桿菌更容易在培養基中培養出來，因此在一定程度上高估了芽孢桿菌的含量；另一方面，在基于PCR的方法的研究中，也有以芽孢桿菌為主的結果[3]，這應該與豆豉的類型有關。在Chen的另一項研究中也發現主要的細菌為乳酸桿菌[21]。

圖3 豆豉中細菌的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the 16S rRNA gene sequences and their phylogenetic relatives

除了乳酸桿菌和芽孢桿菌這類在發酵中起作用的細菌，在這個豆豉樣品中，也發現了潛在的致病菌，YM_JS雖然只有3條序列，卻與導致人類腹瀉的病原菌S.flexneri顯示出高度的相似性。S.flexneri為公認的食源致病菌，在多種類型的食品中發現其存在，并可能導致大規模腹瀉的爆發[22-25]。另一個OTU YM_W2則與E.persicina高度一致，而E.persicina則是植物的病原菌[26]，會導致豌豆苗萎蔫[27]，暗示了用來制作豆豉的大豆可能有過細菌性疾病。在市場隨機購買的豆豉樣品中發現的這兩個屬于變形菌門的OTU，一個是人類的致病菌，一個是食品原料的致病菌，無不顯示著食品安全問題的緊迫性，對于致病菌快速準確的檢測是非常必要的[28]。

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