兒童脂肪干細胞與多種尿道生物支架相容性的對比研究＊

西安市兒童醫院泌尿外科（西安710043） 幸世龍 馬斌芳 張敬悌 白 明 葛文安

本文用體外脂肪干細胞復合培養來對多種尿道生物支架的相容性進行一些對比研究［1～4］，以期能夠得到這些生物支架相容性的數據和結果，現報道如下。

材料與方法

1 材 料

1．1 設計：細胞學體外培養對比觀察實驗。

1．2 時間及地點：2012年12月至2013年12月在本院實驗中心完成。

1．3 組織來源：所用脂肪組織來源于我院泌尿外科1～3歲鞘膜積液的5例患兒術中所取腹股溝區脂肪組織，1例為女性，4例為男性，供體無傳染病及其他特殊疾病，平均脂肪吸取物大概為10ml。

2 實驗方法

2．1 脂肪干細胞的分離、純化、培養及傳代：在無菌條件下，把脂肪組織用PBS反復沖洗，并用0．1%I型膠原酶在37℃的條件下消化60min，后用等體積高糖DMEM＋10%FBS中和酶活性，再用1100r／min離心5min。棄掉上清，重懸沉淀，200目篩網過濾，細胞懸液使用細胞記數板進行計數，按2×104／培養瓶接種于25cm2培養瓶中，在培養瓶內加入完全培養基，37℃、5%（體積分數）CO2孵箱培養，每3d換液1次。細胞培養至80%融合時，用胰酶／EDTA消化并按1∶1的比例傳代［5］。

2．2 支架材料的制作：分別制作膀胱脫細胞基質（BAMG）、小腸粘膜下層組織（SIS）、脫細胞尿道海綿體基質。

2．3 脫細胞尿道海綿體基質制作：取用豬陰莖組織，將尿道海綿體基質分離出，用混合脫細胞液震蕩處理14d，存儲于2．5g／L氯霉素溶液內備用。

2．4 細胞-支架復合物的制作：消化第4代脂肪干細胞，制備細胞懸液，濃度為1×108／l，后將表面接種了0．2ml細胞懸液的生物支架材料放在12孔培養板內，靜置4h后，把含10%胎牛血清的DMEM培養液加入到培養板內，置于37℃，5%CO2的培養箱中培育。使用倒置顯微鏡觀察細胞在支架材料上粘附、生長、分裂情況。

2．5 細胞粘附率的計算：取24孔培養板，將10塊生物支架材料放入孔內，大小為5mm×10mm×2mm，將5×107／L細胞懸液0．2ml滴到材料上，靜置4h，后在培養箱復合培養4h，將細胞懸液換到已加培養液的另一培養板，把原培養板中溢出的細胞消化收集，用細胞計數板計數，獲得流失細胞數；細胞與材料的復合物繼續培養24h，輕輕晃動培養液，收集培養液中的細胞。

2．6 XTT比色法測定細胞增殖：取96孔板，把10塊生物支架材料放入96孔培養板內，同時設置空白對照組10個孔。把5×107／L細胞懸液接種在生物材料商，復3孔，后放置培養箱培養7d，以主波長480 nm，參比波長630nm在酶標儀上比色，測定吸光度。

2．7 觀察指標［6］：兒童脂肪干細胞接種于不同生物支架后的生長、增殖及粘附。

3 統計學方法 采用統計學軟件SPSS 20．0進行分析，計量資料以±s表示，采用方差齊性分析與q檢驗；計數資料比較用χ2檢驗。P＜0．05為差異具有統計學意義。

結 果

1 倒置相差顯微鏡觀察脂肪干細胞滲透情況在培養第7天，所有生物支架材料均有細胞生長。細胞呈圓形，無異常形態細胞，粘附較好，極少數脫落，說明脂肪干細胞能在上述3種生物支架材料上正常生長與增殖。

2 細胞黏附率 BAGM的3d、7d細胞黏附率分別為45．77%±12．76%，42．45%±10．56%，SIS的3d、7d細胞黏附率分別為37．39%±9．66%，36．33%±8．44%，脫細胞尿道海綿體基質的3d、7d細胞黏附率分別為30．34%±13．12%，31．01%±9．23%，三種生物支架材料的3d、7d細胞黏附率不完全相同，差異有統計學意義，P＜0．05；3d細胞黏附率兩兩比較，BAMG與脫細胞尿道海綿體基質差異有統計學意義，P＜0．05，而其他無明顯差異，P＞0．05；7d細胞黏附率兩兩比較，BAMG脫細胞尿道海綿體基質差異有統計學意義，P＜0．05，而其他無明顯差異，P＞0．05。

3 細胞活性的XTT法測定 各生物支架材料的A值隨時間而增加，到第7天最高，結果顯示各組A值差異無統計學意義，P＞0．05，見附表。

附表 3組生物支架材料與空白對照A值比較（n＝10）

討 論

脂肪干細胞具有多向分化潛能，不僅能分化為傳統的間充質細胞系，還具有向非間充質細胞橫向分化。近年來在學術界得到了極大的重視，被運用于各種研究中。而作為良好的組織工程的種子細胞，它能夠很好地填充細胞生物支架的孔隙，使得生物支架更加穩固，同時因為它的多向分化能力，生物支架的生理功能也更加完善，因此對脂肪干細胞與組織工程中各個材料相容性的研究也在廣泛開展中。

尿道的修復一直以來是泌尿外科比較棘手的一個問題，傳統的修補方法存在較多的問題，而近年來隨著學科的廣泛交叉，組織工程得到了極大的進步，多種新型支架材料，尤其是生物支架被開放出來，新型支架修復材料迅猛地發展，主要有以下幾種：①天然細胞外基質；②細胞外基質衍生物1、I、等；③人工合成聚合物盡管能大規模生產滿足臨床及研究的需求，但由于組織相容性較差，目前已很少使用。而生物支架材料相比而言其獨特的優勢是：①具有較好的生物可降解性、相容性；②不引發免疫排斥反應；③無毒性、可塑性等。其中的一部分已經在臨床或者動物實驗中應用，但是這些材料的生物相容性沒有得到應有的關注，因此作者才進行此次研究。

本次研究結果表明，在倒置相差顯微鏡的連續觀察中，3種材料上的脂肪干細胞生長良好，沒有出現明顯的異常形態細胞，可見脂肪干細胞能夠在這3種生物支架材料上順利生長、增殖；在細胞黏附率的觀察上，三種生物支架材料的3d、7d細胞黏附率不完全相同，差異有統計學意義（P＜0．05），其中，培養3d細胞黏附率兩兩比較，BAMG與脫細胞尿道海綿體基質差異有統計學意義（P＜0．05），而其他無明顯差異（P＞0．05），培養7d細胞黏附率兩兩比較，BAMG與脫細胞尿道海綿體基質差異有統計學意義（P＜0．05），而其他無明顯差異（P＞0．05）。這與馮超［8］等在天然及合成尿道重建支架材料的生物相容性及力學性能研究中部分結果相近。以上結果表明：3種生物支架材料的細胞活性無明顯差異（P＞0．05），它們與脂肪干細胞有良好的組織相容性。從細胞黏附率來看，BAMG比脫細胞尿道海綿體基質黏附率高，具體原因尚不清楚，可能與BAMG的膠原結構更加完整有關系，需要進一步探索。

綜上所述，3種生物支架材料與兒童脂肪干細胞的生物相容性都是能夠接受的，干細胞能在其上正常生長、增殖，具有良好的形態，BAMG的細胞黏附率較脫細胞尿道海綿體基質更高，BAMG或是進行尿道修復的較佳生物支架材料。但是，雖然這3種生物支架材料與脂肪干細胞生物相容性是可以的，不過畢竟是體外混合培養，沒有體內那么復雜的生理環境，不會受到各種激素與細胞因子等的影響，因此本實驗依然只是尿道生物支架與脂肪干細胞相容性的初步工作，動物實驗是十分必要的。另外，脂肪干細胞的安全性至今依然沒有得到肯定的保證，如果在體內發生癌變，后果不堪設想，因此，脂肪干細胞與尿道生物支架的臨床應用還任重而道遠，希望廣大同仁能夠解決這一難題，使得尿道修復得到跨時代的進步。

［1］ 黃廣林，滿立波，李貴忠，等．組織工程管狀材料修復長段尿道缺損的實驗研究［J］．北京醫學，2009，31（1）：4-6．

［2］ 郭 翔，趙 珩．三維支架材料與脂肪干細胞的生物相容性［J］．中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（38）：7080-7084．

［3］ 田 霖，孫筱放，劉海波，等．人脂肪干細胞的分離培養與生物學特性［J］．中國組織工程，2012，16（32）：5946-5952．

［4］ 孫江維，王 東，孫海鈺．人成骨細胞與復合型多孔生物支架降解產物的相容性［J］．中國組織工程研究，2013，17（51）：8869-8874．

［5］ 陳光平，羅盛康，徐 翔，等．人脂肪干細胞體外增殖的安全性評價［J］．廣東醫學院學報，2009，27（2）：126-129．

［6］ 楊 柳，姜 南，徐揚陽，等．膨體聚四氟乙烯與人體脂肪干細胞的體外生物相容性［J］．中國組織工程研究，2014，18（12）：1932-1937．