石墨化碳纖維-離子液體復合物構建過氧化氫酶傳感器研究

樓炬峰 姚則慶 陳光柱

(嘉興學院生物與化學工程學院，浙江 嘉興314001)

石墨化碳纖維或離子液體修飾電極都可以有效提高電極性能[1-2]。在過氧化氫酶研究領域，Pamula E和Rouxhet PG細致研究了碳纖維吸附過氧化氫酶（Cat）的行為及影響因素，發現碳纖維的表面功能對過氧化氫酶的吸附具有一定的影響，含有生物相容性基團的碳纖維對過氧化氫酶表現較好的吸附性能[3]。Saadati,S(Saadati,Shagayegh)等將過氧化氫酶與氨基化離子液體層層組裝到鈦基納米管表面，探究了過氧化氫酶的直接電子傳遞行為，以及構建在電子傳遞基礎之上的過氧化氫傳感器，充分體現了其靈敏性與生物相容性[4]。Chen等進一步研究了離子液體和DNA的復合物對幾種氧化還原蛋白質的電子傳遞促進行為，研究發現離子液體對蛋白質分子具備很好的生物相容性，實現了蛋白質和電極之間的直徑電子傳遞行為，為構建相應的生物傳感器奠定了很好的前期基礎[5]。電化學還原制備的氧化石墨烯修飾電極后，可以進一步促進過氧化氫酶的吸附和電子傳遞，結合的過氧化氫酶對過氧化氫具備非常靈敏的催化性能，線性范圍為0.05到1.91 uM，靈敏度達7.76 uA mM-1 cm-2[6]。

至今，石墨化碳纖維-離子液體復合物修飾電極構建過氧化氫酶的研究還未見報道，開展該領域的實驗具有一定的探索意義和研究價值。本項目將首先制備石墨化碳纖維-離子液體的復合材料，并將其用于過氧化氫酶的電子傳遞研究領域，探討酶結構和性能、組建新型傳感器。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

CHI-660B型電化學工作站（上海辰華儀器公司）；S-4800型掃描電子顯微鏡（日本日立公司）。石墨化碳纖維GNFS(中國科學院成都有機化學有限公司)，使用之前經濃硫酸-濃硝酸混合液（體積比3:1）進一步純化；1-羧丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽、1-羧甲基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（IL），中國科學院蘭州化物所）；過氧化氫酶Cat（美國Sigma公司），用時當天配制；實驗室用水為超純水。

1.2 復合材料的制備及修飾電極構建

取15μL 1-羧丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽和5 mg GNFS于瑪瑙研體A中，取15μL 1-羧甲基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽和5 mg GNFS于瑪瑙研體B中，各研磨1小時，放置30min后，分別將它們轉移至離心管，超聲清洗、離心，去除未結合的離子液體，得到石墨化碳纖維1-羧甲基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽復合物（記做GNFS-IL（A））和石墨化碳纖維1-羧丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽復合物（記做GNFS-IL（B）），分別分散到5ml水中備用。取6mgCat溶解于1ml中，制得6 mg/ml（前后形式一致）的Cat溶液。

取上述各分散液20μL滴到磨平、洗凈、曬干的玻碳電極表面，自然揮發后，形成薄且均勻的修飾層，即制得復合物修飾（玻碳）電極（GNFS-IL（A）/GCE,GNFS-IL（B）/GCE）。之后，各修飾電極浸入6 mg/ml的Cat溶液中，過夜，取出水洗，待用。

1.3 實驗方法

電化學檢測采用三電極體系：復合物修飾（玻碳）電極為工作電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，鉑電極為對電極。以0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）為底液，通入純氮氣除去溶解氧、并保持氮氣氛圍。實驗均在室溫下進行。

2 結果與討論

2.1 復合物的掃描電鏡特征

纖維是指長度比直徑大千倍以上且具有一定柔韌性和強力的纖細物質。圖1分別是GNFS-IL（A）和GNFS-IL（B）復合物的掃描電鏡(SEM)圖。從圖中可以看出：兩種復合物中已基本觀察不到GNFS的纖維結構，并且在一定程度上表現出黏連的現象，在GNFS-IL（A）圖中表現得比較清晰，有大片粘在一起的形態，整體呈片狀，且片狀面積較大。而相較于GNFS-IL（A），GNFS-IL（B）局部圖則比較整齊規則，出現了小范圍的黏連，片狀面積較小，除了小碎片狀的形態，還有一些條狀的形態。以上特征的出現主要是由于GNFS和IL之間的結合，IL的凝膠膜引發了GNFS表面形態上的變化。

圖1 復合物的掃描電鏡圖

2.2 循環伏安法（CV）

圖2為復合物修飾（玻碳）電極,GNFS-IL（A）/GCE,GNFS-IL（B）/GCE）浸入6 mg/ml的Cat溶液中，過夜，取出水洗，置于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，經過幾次循環伏安掃描后得到的伏安循環圖。兩電極在相同條件下進行循環伏安掃描，都出現了氧化還原信號。其中a圖是GNFS-IL（A）復合物的掃描圖像，在-0.46V(vs.SCE）左右可觀察到一對△Ep=Epa-Epc=0.489 V-0.439 V=0.05 V，即50 mV左右的還原氧化峰。而b圖是復合物GNFS-IL（B）的掃描圖像，在-0.47 V(vs.SCE）左右可觀察到一對△Ep=Ep a-E pc=0.488 V-0.443 V=0.045 V，即45 mV左右的還原氧化峰。從圖中不難發現，石墨化碳纖維—1-羧甲基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽復合物表現出了更好的電化學響應，氧化還原電對的特征峰更加明顯。經過多次重復試驗，結果也印證了這一點：Cat在GNFS-IL（A）復合物修飾的電極上可以更好的實現其與電極的直接電子傳遞。所以在研究后續相關的問題時我們將會更多的關注GNFS-IL（A）復合物。

圖2 伏安循環圖

GNFS-IL（A）制得的伏安循環曲線中可以看出，其陰極峰電勢Epc為-0.489 V，陽極峰電勢Epa為-0.439 V，電勢差為50 mV，式電勢E0以（Epc+Epa）/2=-0.464 V，這是Cat血紅素輔基中氧化還原中心Fe(III)/Fe(II)的氧化還原特征峰。在此范圍內，用高溫處理的Cat進行實驗，并沒有出現氧化還原峰，也印證了上面的觀點。

隨著掃描速度的增加，峰電流不斷增大，而且還原峰電位負移,氧化峰電位正移。而△Ep都在50 mV以內，表明在GNFS-IL（A）/GCE中Cat的電子傳遞可逆程度較高，一方面是因為IL凝膠膜為Cat提供了微水環境，有利于保持其分子活性[7-8]；另一方面，GNFS-IL具備良好的生物相容性和導電性，可與Cat進行快速的電子傳遞。根據準可逆薄層電化學過程的Laviron方程[9]可求出電活性物質發生電極反應時的電子轉移數為0.927（≈1），說明GNFS-IL（A）/GCE中的Cat發生了單電子轉移準可逆的氧化還原過程。

2.3 pH值對循環伏安行為的影響

圖3為不同pH條件下的Cat響應，用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉制備了pH分別為3,4,5,6,7,8,9,10,11的緩沖溶液，分別針對復合物GNFS-IL（A）制得伏安循環圖，但為了更好地在一張圖中呈現出來，這里只選出pH為2.99,5.01,7.00的緩沖溶液下的Cat響應。可以觀察到，隨著底液pH值的增大，復合物修飾（玻碳）電極的循環伏安陰陽兩極峰電位均發生明顯負移，而峰形，峰電流沒有明顯變化。將CV陰極峰電位和陽極峰電位的平均值E0，作為Cat電對式量電位的近似值，來考察pH值對式量電位的影響[10]（如圖4）。結果表明，E0，與pH值之間存在良好的線性關系，其斜率為-49.3 mV/pH。由圖可得，在pH 3.0到8.0之間時，其斜率的絕對值其實大于49.3 mV/pH，這樣實驗值就更接近18。C時可逆體系的理論值-57.7 mV/pH說明復合物修飾的（玻碳）電極中的Cat發生一個電子轉移的同時還有可能伴隨一個質子的轉移。但當pH值大于8時，斜率的絕對值就變小了，說明E0，隨pH值變化的趨勢變緩。

3 結論

憑借IL優良的溶解性，通過研磨它和GNFS的混合物，制備了新型的二元復合物。然后在GNFS-IL/GCE上修飾的Cat表現出了良好的電化學響應，顯示Cat發生了單電子轉移準可逆的氧化還原過程。體系的pH對循環伏安峰的位置有明顯的影響，且復合物修飾的（玻碳）電極中的Cat發生一個電子轉移的同時還有可能伴隨一個質子的轉移。結果表明GNFS-IL/GCE在構建過氧化氫酶傳感器研究領域具備潛在的應用前景。

［1］Hasanzadeh,M,Shadjou,N,Eskandani,M,de la Guardia,M,Roomtemperature ionic liquid-based electrochemical nanobiosensors[J].Trac-trends in Analytical Chemistry,2012,41:58-74.

［2］Huang,JS,Liu,Y,You,TY,Carbon nanofiber based electrochemical biosensors:A review[J].Analytical Methods.2010,2(3):202-211.

［3］Pamula,E,Rouxhet,PG,Influence of surface properties of carbon fibers on the adsorption of catalase[J].Carbon,43(7):1432-1438.

［4］Saadati,S,Salimi,A,Hallaj,R,Rostami,A,Analytical Chemical ACTA[J].2012,753:32-41.

［5］Chen,T,Xiong,HY,Wen,W,Zhang,XH,Wang,SF,Bioelectrochemistry[J].2013,91:8-14.

［6］Ting,SW,Periasamy,AP,Chen,SM.Saraswathi,R,International Journal of Electrochemical Science[J].2011,6(10):4438-4453.

［7］Compton D L,Laszlo JA.Journal of Electroanalytical Chemistry[J].2002,520:71.

［8］Ding SF,Wei,W,Zhao GC.Electrochemistry Communications[J].2007,9(9):2202.

［9］Laviron E.Journal of Electroanalytical Chemistry[J].1979,101:19.

［10］LI Min,CHEN Zhi-min,XIN Xian-rong.Direct Electrochemistry of Catalase Incorporated in Collagen Films[J].Journal of Shanxi University,2006,29(2):179-181.