蘇鐘豬個體身份SNP 識別的數字條形碼編制

胡肄農， 丁 潛， 紀紅軍， 王曉曉， 朱振坤，4， 趙慶順， 邢光東

(1.江蘇省農業科學院獸醫研究所/農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室/國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇南京210014;2.江蘇省農業科學院畜牧研究所，江蘇 南京210014;3.南京大學模式動物研究所，江蘇 南京210061;4.南通大學公共衛生學院，江蘇 南通226001)

中國是豬肉生產和消費大國，豬肉是中國居民消費的最主要的肉類產品。但近年來食品安全問題頻發，嚴重影響了消費者的健康，所以建立可靠的豬肉產品溯源系統，實現豬場到餐桌全程雙向可追蹤溯源，對遏制養豬生產中瘦肉精、重金屬等的濫用，控制獸藥的殘留，傳染性疾病的傳播，促進養豬業的健康發展等起十分重要的作用。

豬肉產品的溯源技術和方法很多［1-2］，目前大都采用耳標等標簽溯源，這一技術具有操作簡單和成本低的特點，但因其標簽易損、易脫落丟失、易混淆，且易在豬活體、胴體和豬肉產品間分離而難以保障豬肉產品溯源的準確性。基因組DNA 存在于動物每個細胞，不因動物產品加工等發生改變，具有準確、可靠等特點而被看好用于豬肉產品溯源［3］。目前研究熱點主要集中在微衛星或單核苷酸標記的多態性(SNPs)如何用于豬肉產品的溯源［4-6］。SNP 是指同一物種不同成員間或同一個體的成對染色體在同一基因組DNA 位點上出現的單個核苷酸之間的變異，是可遺傳的變異中最常見的一種，具有分布廣、密度高的特點，SNP 常被開發為DNA 指紋。本研究通過挖掘蘇鐘豬基因組DNA 的SNP 位點，研究編制蘇鐘豬個體身份識別的DNA 條形碼并形成相應的數字條形碼，為豬種個體身份識別及肉產品溯源方法的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用豬為江蘇省農業科學院選育的江蘇省級品種蘇鐘豬。選取7 頭公豬和12 頭母豬所生的96頭蘇鐘豬，并拔取豬毛(含毛囊)，剪短至1.5 cm，用DNA MiniExtract 試劑盒(南京潤邦生物技術有限公司生產)制備DNA 模板。單個樣本DNA 模板制備過程為:將數根豬毛毛囊端朝下插入裝有17.6 μl DNA MiniExtract 的PCR 管中，PCR 儀中95 ℃ 5 min，16 ℃1 min 后，加入濃度為20 mg/ml蛋白酶K2.4 μl，55 ℃2 h，95 ℃10 min，16 ℃1 min，離心取上清液作PCR 擴增模板。混合樣本DNA 模板制備過程為:每頭豬選取1 根豬毛，毛囊端朝下混合插入裝有352 μl DNA MiniExtract 的離心管中，95 ℃水浴5min 后，冷卻至常溫，加濃度為20 mg/ml蛋白酶K48 μl，55 ℃水浴2 h，冷卻至常溫后離心取上清液作PCR 擴增模板。

1.2 引物設計與PCR 擴增

初期根據GenBank 登錄的豬基因序列設計29對引物，并用混合樣本DNA 模板擴增，擴增產物直接測序并選擇測序圖譜背景干凈，序列閱讀無歧義且擴增產物存在SNP 位點的7 對引物用于蘇鐘豬個體身份DNA 識別的數字條形碼編制。7 對引物擴增基因的GenBank 序列登錄號分別為AF327369、AF034974、AF473820、X68247、AJ251197、AF038553和M29939。

7 對引物PCR 反應體系總體積均為20 μl，其中:Milli-Q 13.1 μl、25 mmol/L Mg2+2.0 μl、10 ×Buffer 2.0 μl、5 mmol/L dNTP 0.8 μl、5 μmol/L正反向游引物各1.0 μl、Taq酶0.1 μl、混合樣本或單個樣本DNA 模板1.0 μl。反應條件:95 ℃預變性2 min;95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s 或60 s，共35 個循環;72 ℃延伸10 min。各引物對的退火溫度和延伸時間見表1。

1.3 擴增片段SNP 位點篩選、個體身份識別的DNA 條形碼及相應的數字條形碼編制

7 對引物共擴增52 個SNP 位點，結合后續的單個樣本DNA 模板擴增產物中的SNP 位點關聯性分析(基因分型完全一致的SNP 位點保留其一)及雜合度(H≥0.1)計算，最終確定41 個SNP 位點用于蘇鐘豬個體身份識別的DNA 條形碼編制。這些SNP 位點以擴增產物中堿基所在的順序位置標記，其中正向引物的第1 個堿基標記為+1(表2)。數字條形碼編制時，41 個SNP 位點先組合形成DNA 條形碼;DNA 條形碼中SNP 位點排列，以引物對1 ～7 依次排列，其中每對引物的SNP 位點以5'至3'順序依次排列(表2)。DNA 條形碼中10種SNP 位點的基因型AA、TT、GG、CC、AT、AG、AC、TG、TC、GC 分別由數字0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 共10 個阿拉伯數字代替，形成相應的數字條形碼。

表1 各引物對及相應的退火溫度和延伸時間Table 1 Primers and their annealing temperatures and extending times for PCR reactions

表2 用于豬個體身份識別的7 對引物擴增的SNP 位點Table 2 SNPs used for identification of pig individuals amplified by 7 primer pairs

2 結果與分析

根據41 個SNP 位點編制的數字條形碼，很好地區分了96 頭蘇鐘豬的個體身份，且區分度較好(表3)。96 頭蘇鐘豬是7 頭公豬、12 頭母豬所生后代，其中大多為全同胞。理論上，全同胞遺傳背景基本相同或相近，個體身份最難識別，編制的數字條形碼差異性應該較小，但結果卻與之不相符。例如1-12 號是全同胞豬，它們的數字條形碼一一比對結果發現，5、6 號豬差異最小，數字條形碼只有2 對引物擴增的4 個SNP 位點存在差異(表3 中用黑體字表示);但7、8 號豬卻存在30 個SNP 位點的差異(表3中用黑體字表示)，這或許與父母本41 個SNP 位點的雜合狀態有關。

表3 編制的用于個體身份識別的96 頭蘇鐘豬數字條形碼Table 3 Digital barcodes used for identification of Suzhong swine individuals

3 結論

DNA 存在于動物的每個細胞之中，且不受食品加工等人為影響，具有準確、可靠等特點，因此利用DNA 進行個體身份識別或肉產品溯源，是一種有效的遺傳學方法。SNP 是基因組DNA 變化的最簡單形式［7］，在基因組中普遍存在，頻率大概是0.1%或以上［8］，篩選相對容易;而且動物個體不同染色體的SNP 位點組合形成的信息豐富，因此SNP 常被開發為DNA 指紋，且可用于動物個體身份識別。以豬(共19 對染色體)為例，假如一對引物僅擴增1 個SNP 位點，那么針對19 條染色體的19 對引物擴增的SNP 位點可組合形成319種基因型，即可用于識別約1.1 ×109頭豬的個體身份識別或肉產品溯源。而且針對高突變區的1 對引物可同時擴增出多個SNP 位點，雖然擴增片段連鎖，但常常存在多種基因型，這些引物對擴增片段組合形成的信息更為豐富。本研究篩選7 對引物，擴增52 個SNP 位點，經關聯性分析及雜合度過濾(H≥0.1)后，選留41 個SNP位點，用于蘇鐘豬個體身份識別。96 頭蘇鐘豬樣本的擴增產物中，分離到的基因型數分別為9、11、7、20、3、10 和12 種。7 對引物擴增片段可組合成9 ×11 ×7 ×20 ×3 ×10 ×12 =4 989 600種基因型，理論上可用于近5.0 ×106頭豬個體身份DNA 識別的數字條形碼編制，基本可以滿足規模蘇鐘豬養豬場豬的個體身份識別。

同時，雖然不同豬種共有一些SNP 位點，但由于種群的地理隔絕，可能導致SNP 在不同種群中的頻率不同，而且一個在某個種群或種族中常見的SNP 等位基因很少出現在另一個種群或種族內。因此，本研究所篩選的蘇鐘豬高雜合度SNP 位點，可滿足蘇鐘豬的個體身份識別及肉產品溯源所需，其他豬種的個體身份識別，需要通過挖掘品種自有的高雜合度SNP 位點，重新組合或調整SNP 條形碼識別技術，提高個體身份識別的準確率。

DNA 個體身份識別具有準確、可靠的特點，可優選用于種豬個體身份識別的條形碼編制及檔案庫建設。目前，DNA 個體身份識別成本較耳標等識別方法相對較高，豬場每頭豬編制SNP 個體身份條形碼不太現實，但可以在偶發事件需要精準溯源時，作為耳標等識別方法的一種補充。同時，規模豬場可以分批備份出售或待屠宰豬樣本，通過編制并比對待識別豬個體或同批次備份豬樣本的數字條形碼，在大幅降低溯源成本的同時，達到肉產品溯源目的。隨著基因測序技術的進步及成本的大幅降低，不久的將來DNA 個體身份識別技術將有廣泛的應用市場。

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