硝酸還原酶活性響應的物種特異性

趙念席， 沈廣爽， 石雪芹

(南開大學 生命科學學院，天津300071)

0 引 言

硝酸還原酶(Nitrate Reductase，NR)是高等植物氮代謝的關鍵酶。植物的氮源主要是無機氮化物，而無機氮化物中又以銨鹽和硝酸鹽為主，約占土壤含氮量的1% ～2%，植物吸收銨鹽后可直接用于氨基酸的合成，而如果吸收了硝酸鹽，則必須通過NR 進行代謝還原才能被植物利用［1］。另一方面，因為NR 與植物吸收利用氮肥有關，對農作物產量和品質有重要影響，因而NR 活性被當作植物營養或農田施肥的指標之一，也可作為品種選育的指標之一，因此關于NR 活性影響的研究也具有重要的實際應用價值［2-4］。

基于NR 的重要性，多數高校會在本科植物生物學實驗中安排NR 活性測定，其中，實驗中一般都會重點強調NR 是一種誘導酶，通常在有NO－3存在時，會誘導NR 的活性，且光照能提高NR 活性。因此，在準備實驗材料過程中，注重KNO3誘導過程和光照過程。但我們多年實驗經驗證明:有許多植物材料經誘導也很難檢測到NR 活性，還有一些材料非誘導對照組和誘導組NR 活性無顯著差別。因而，尋找并確定好的本科實驗材料成為本科實驗教學工作的一個關鍵點［5-6］，如果選不對實驗材料會使整個實驗失敗，學生則不能準確掌握知識點。然而，隨著科學的發展和技術的進步，關于NR 活性調節的可能機制已經被廣泛研究。結果表明:除受到NO－3 底物濃度、光，以及培養環境因子等方面的影響外［7-9］;在植物N 代謝中，NH+4濃度對NR 活性也有影響，且對不同植物的影響方式并不一致［10-12］，但關于遺傳因素對NR 活性的影響涉及較少，從而使得本科教學中將NR 活性的大小和誘導響應作為一個普遍規律來講解，其實作為物種選育的指標之一，NR 應該會具有物種特異性和品系特異性。因此，對植物NR 活性的特異性的了解不僅對提高農業施肥效率等方面具有重要作用，對學生探究其原因也具有興趣引導的作用。

隨著高校綜合性實驗的逐漸推進，以培養學生的創新思維習慣，提高分析問題和解決問題的能力為出發點，我們在試驗教學改革中設置綜合實驗，檢測了不同植物硝酸還原酶對KNO3誘導的敏感性問題，并進一步檢測了兩種N 源對其中3 種植物硝酸還原酶誘導敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

本文選擇小麥(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、辣 椒(Capsicum annuum)、白 菜(Beassica pekinensis)、蘿卜(Raphanus sativus)、番茄(Lycopersicon esculintum)、油菜(Brassica campestris)作為本研究所用的實驗材料。

1.2 幼苗移栽和無土栽培

種子發芽3 ～4 周后，將這些植物幼苗移栽至1 L培養缸中1 ×Hoagland(缺N 素)營養液培養，每種植物6 盆，其中3 盆用于NR 的誘導，另外3 盆作為對照，分別作好標記。

1.3 KNO3 對植物硝酸還原酶的誘導

3 d 后，在9:00 ～10:00 中向誘導組處理溶液中加入6 mL 1 mol/L KNO3溶液，而向對照組中加入6 mL蒸餾水，放置在人工光源400 μmol/(m2·s)下光照培養，誘導硝酸還原酶活性。2 d 后14:00 ～16:00(選擇此時間段是希望與學生上課時間同步)，用于硝酸還原酶活性的測定。

1.4 硝酸還原酶活性的測定

試劑配置參考高玉葆等［2］略作修改，其中磺胺和萘基乙烯胺溶液參考劉亞麗等［13］配置。

每種植物材料在不同處理條件下采集樣品3 份，采用離體法測定NR 活性。具體方法為:

(1)每組處理樣品分別隨機選取均勻植物葉片3份，每份0.5 g，于研缽中剪碎置低溫冰箱冰凍30 min，取出置于冰浴中并加少量石英砂及4 mL 提取緩沖液，研磨成勻漿，轉移入離心管中，在4 ℃8 000 r/min 離心5 min，上清液即為粗酶提取液。

(2)從每份粗酶液中吸取2 個1 mL，其中一份加入0.1 mol/L KNO3磷酸緩沖液和NADH 溶液(0. 1 mol/L pH7.5 磷酸緩沖液溶液配制)，進行酶反應;另一份加入0.1 mol/L KNO3磷酸緩沖液和0.1 mol/L pH7.5 磷酸緩沖液溶液而不加入外源的NADH，作為參比。所有溶液混勻，在25 ℃保溫30 min。

(3)保溫結束后立即加入1 mL 1% 磺胺溶液終止酶反應，再加1 mL 0.2%萘基乙烯胺溶液，黑暗中顯色30 min 后(此次保溫時間與標準曲線測定時的保溫時間需嚴格一致)，過濾，以參比管為空白參比，測定酶反應組濾色在540 nm 的光密度。

1.5 不同N 源對硝酸還原酶誘導活性的影響

對番茄、辣椒和小麥實施不同的N 素培養，營養液在1 ×Hoagland 營養液的基礎上略作修改，其中包括以(NH4)2SO4作為N 源和以KNO3作為N 源2 種培養液，分別記作-N 和-N，每種植物在每種培養液下培養6 盆，其中3 盆用于硝酸還原酶的誘導，另外3 盆作為對照，分別作好標記，每種植物共培養12 盆，3 種植物共36 盆。3 d 后，實施1.3 節和1.4 節內容。

1.6 數據處理

將所得數據輸入Excel，借助SPSS 中的方差分析對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同植物材料NR 活性的差異

對缺N 營養液中的植物材料進行硝酸還原酶的誘導，結果表明各材料間NR 活性有顯著差異。其中，除番茄外，其余6 中植物均誘導測得NR 活性;但是在這6 種測得NR 活性的植物材料中，僅有辣椒在未誘導組未檢測到活性，而其他5 種植物中均檢測到很高的NR 活性;活性大小方面6 種植物都很好，對于本科實驗來講都還比較合適(見表1)。

表1 不同植物硝酸還原酶活性的差異

2.2 不同N 源對硝酸還原酶誘導活性的影響

選擇有代表性且在本科實驗教學中經常使用的小麥、辣椒和番茄為實驗材料，研究不同N 源對NR 活性的影響。結果表明:2 種N 源對3 種植物KNO3誘導敏感性的影響具有物種特異性。對于番茄，在NH+4-N培養條件下，添加KNO3誘導能檢測到微弱的NR 活性，其他3種培養條件均未檢測到NR活性;對于辣椒來講，4 種處理均檢測到NR 活性，但在培養條件下，添加KNO3誘導對NR 活性無顯著提高，而-N 培養條件下，KNO3誘導能顯著提高NR 活性;對于小麥來講，4 種處理均檢測到NR 活性，培養-N 條件下，對照組檢測到很低的NR 活性，添加KNO3誘 導 能 顯 著 提 高 NR 活 性(達 8. 68 μg/(g·h));-N 培養條件下，未誘導組和添加KNO3誘導處理所得NR 活性接近，表明KNO3添加對在-N 培養的小麥NR 不能起到誘導作用。

表2 不同培養條件對番茄、辣椒和小麥硝酸還原酶活性誘導的差異

3 討 論

本研究結果證明:在誘導環境相對適宜并相同的情況下，物種的差異(即遺傳因素)對NR 誘導活性且決定性作用。本研究中辣椒(Capsicum annuum)在無KNO3的添加的對照組中未檢測到NR 活性，而在KNO3的添加的誘導組中檢測到很好的活性，從某種程度上能證明NO－3的誘導作用;此外，小麥(Triticum aestivum)，大白菜(Beassica pekinensis)，蘿卜(Raphanus sativus)，玉米(Zea mays)，油菜(Brassica campestris)在無KNO3添加的對照組中，仍能檢測出很高的NR 活性，表明NR 誘導中的作用不在于(至少不完全在于)通過影響KNO3的吸收，即已經存在NR 活性的植物，在一定的環境條件下，即使無KNO3的添加也能維持其活性［14］。但本研究中多數物種在添加KNO3的誘導組，NR 活性顯著提高(見表1)。隨著科學研究的進行，NR 作為誘導酶的定義(植物本身不含有，只有外加NO－

3 才能誘導生成)也需要通過正式的教科書進行修訂。其實，林建明等［14］就對NR 的誘導機理提出過有兩種情況:①酶蛋白的重新合成(植物本身不含有，只有外加NO－3，才能誘導生成);②酶前體的活化(說明不一定需要外加NO－3，才能誘導生成)。另外，番茄在對照組和誘導組均未檢測到NR 活性，在其他研究中也有類似的實驗結果，如陶懿偉等［6］實驗中紫藤等6 種植物未檢測到NR 活性，隨著科學的進步，相關機制會逐步清晰。

本研究結果證明:不同形態的氮素對植物體內的NR 活性有不同的影響，可能表現為促進、抑制或者無顯著影響，在相同的培養環境中，主要體現在物種水平上的差異。在本研究中有如下幾種情況:

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