馬爾尼菲青霉菌藥靶基因發掘與利用

摘要：隨著免疫抑制劑、深度化療、廣譜抗生素等的廣泛應用，真菌感染尤其是條件致病真菌感染在艾滋病、惡性腫瘤等病人中發病率日趨升高，成為艾滋病、惡性腫瘤等患者的主要致死因素。其中馬爾尼菲青霉菌感染已被公認是艾滋病指征之一。本文論述了馬爾尼菲青霉菌藥靶基因發掘與利用。

關鍵詞：真菌；馬爾尼菲

在泰國，70%－80%的艾滋病患者感染上馬尼菲青霉病，是繼結核病和隱球酵母病之后的第三大并發病；在香港，10%的愛滋病病人感染上馬尼菲青霉病；在中國大陸，馬尼菲青霉病多發生于廣西、廣東、云南、貴州等地。然而，由于對馬尼菲青霉病及其病原菌認識不夠，經常造成誤診、誤治，死亡率很高。

由于病原真菌屬于真核類生物，開發高效、廣譜的抗真菌藥物一直是舉世公認的難題。目前，臨床上僅有氟康唑、伊曲康唑和兩性霉素B等有限的幾種抗真菌藥物；而且現有抗真菌藥物存在明顯的缺點：作用慢、抗菌譜窄、毒性一般都比較大。另外耐藥菌株的出現（如：馬爾尼菲青霉菌對臨床上廣泛使用的氟康唑具有耐藥性），限制了僅有的幾個抗真菌藥物的使用。但抗真菌藥物的市場潛力巨大，據預測到2007年抗真菌藥物市場份額將達到87億美元（http://www.bccresearch.com），抗真菌藥物的研究仍是目前藥物研發方面的一個熱點。

此外，抗真菌藥物不僅具有很大的市場潛力，也是發展新的抗腫瘤藥物、免疫抑制劑等的一個有效途徑。如臨床上廣泛使用的免疫抑制劑（環孢霉素A、他克莫司、雷酚酸、雷帕霉素等）最初都是作為抗真菌活性藥物來開發的。目前最具開發前景的新一代抗腫瘤藥物埃博霉素是由粘細菌產生的一新型天然細胞毒化合物，通過誘導微管蛋白多聚體形成超穩定態，阻礙有絲分裂，具有抗真菌和抗腫瘤活性。因此，通過對主要引起我國和東南亞地區發病的馬爾尼菲青霉菌，篩選特異的診斷標記物、藥物靶標，展開基因功能研究，不僅為解決臨床診斷和預防奠定基礎，而且也為創新藥物的研發提供一個新的思路。

馬爾尼菲青霉菌是一種溫度調控的二型性真菌，在25°C和37°C下分別為絲狀體型和酵母型。我們知道人的體溫為37°C，馬爾尼菲青霉菌感染人后為酵母型。因此，研究宿主（這里特指人）對病原菌馬爾尼菲青霉菌的形態調控，揭示馬爾尼菲青霉菌二型性變化的機制，將為獲得新的藥物靶標基因，并進行抗真菌藥物的篩選，為全面而深入地研究馬爾尼菲青霉菌分子遺傳和免疫基礎提供契機，也為選擇侯選疫苗抗原和藥物靶標奠定理論基礎。

在國際上首次針對馬爾尼菲青霉菌進行了大規模的基因表達譜研究。通過對馬爾尼菲青霉菌菌絲態、酵母態和萌發孢子三種狀態進行大規模cDNA測序，獲得23000條基因表達序列，組裝后獲得了11367個基因（與估計馬爾尼菲青霉菌基因組基因數一致），其中2185個基因具有完整的起始和終止密碼子。同時利用SAGE技術對馬爾尼菲青霉菌菌絲態、酵母態等狀態進行了基因表達譜研究，初步揭示了馬爾尼菲青霉菌形態轉換中基因表達的特征。在國際上首次針對馬爾尼菲青霉菌進行大規模突變體庫研究。利用T-DNA介導進行大規模馬爾尼菲青霉菌插入突變體技術，獲得了20000多個突變體，從中篩選獲得了近3000個具有明顯表型變化的突變體（包括生長緩慢型2600個、兩相差異23個、菌落形態變化15個和凋亡相關2個），并通過tail-PCR技術鑒定了1000個突變體的側翼序列，其中約1/3位于基因編碼區，2/3可能位于調控區。同時，結合其他真菌種類尤其是莢膜組織孢漿菌和白色念珠菌基因組信息，采用比較基因組和計算生物學等方法研究和評價信號傳導、代謝和調控等通路上的關鍵基因對馬爾尼菲青霉菌二型性變化的影響。著重圍繞信號傳導、代謝和調控等通路上的關鍵功能基因，篩選出一批具有新穎表型的功能基因。為在大規模功能基因篩選的基礎上對重要基因進行深層次的研究奠定了基礎。

在上述工作的基礎上，利用我們針對真菌所建立的RNAi干擾技術，并結合定量PCR和蛋白質表達研究等技術對rpfA和DRK1兩個信號調控基因展開研究。通過研究發現這兩個基因對馬爾尼菲青霉菌青霉菌的形態、生長、產孢等生理過程具有明顯的調控作用。特別值得指出的是DRK1基因對馬爾尼菲青霉菌的生長、形態、發育、細胞壁、細胞核等都具有明顯的調控作用，是我們所發現的一個具有全局調控作用的基因，提示該基因是一個可能的藥物靶標。通過化合物虛擬篩選和活性篩選，獲得了一系列個具有抗真菌活性的化合物并申請了專利，其中3個已經獲得授權。

作者簡介：任雙喜，國家人類基因組南方研究中心副研究員，歷任生物信息學部負責人，主任助理等職，享受國務院政府特殊津貼。。主要研究方向為基因組和生物信息學。他承擔了國家和地方的多項重大科研計劃如國家重點基礎研究發展規劃項目（973 計劃）、國家863 計劃項目、國家863計劃重大專項、國家自然科學基金重大項目、上海市科技攻關重大項目和中法先進合作項目等。此外，還參與了人類基因組1％測序計劃和腎上腺-垂體-下丘腦軸、肝癌及癌旁組織全長基因的克隆和生物信息學分析工作以及人類全長基因功能注釋的國際合作。在過去的幾年里，他帶領課題組在相關領域取得了突出的成績，獲得了一系列創造性的科技成果，在《自然》、《科學》等世界頂級權威雜志發表學術論文。同時，他非常重視科研成果的知識產權保護和相關產品的研發，獲得具有發展新的診斷手段和疫苗開發潛力的基因2個，獲得抗病原微生物活性化合物20多個，已經獲得專利3項。曾獲教育部科技進步一等獎、上海市自然科學進步獎二等獎、教育部科技成果完成者證書、中國醫藥科技十大新聞和第一屆“上海市科教黨委系統青年科技創新人才獎”等。