正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選水楊梅中總黃酮的提取工藝

陳程，馮鎖民

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

水楊梅(Geum aleppicum)為薔薇科(Rosace-ae)水楊梅屬(Geum)多年生草本植物，主要分布于我國西北、華北、東北等地區(qū)［1］。民間以其全草或根入藥，具有清熱解毒、利尿、消腫止痛之功效［2］。水楊梅醇提物對(duì)白血病和宮頸癌細(xì)胞有一定抑制作用［3］。從該屬植物中分離到的化合物有鞣質(zhì)、三萜、黃酮等［4］。篩選抗氧化活性中藥的研究表明，水楊梅的總酚和總黃酮含量較高，體外消除自由基能力強(qiáng)，對(duì)CCl4所致小鼠急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用［5-6］。本文采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)水楊梅中黃酮類化學(xué)成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，為水楊梅中黃酮類化合物的利用與開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

水楊梅，采自陜西秦嶺山區(qū)紅河谷，經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室鑒定為薔薇科(Rosace-ae)水楊梅屬(Geum)植物水楊梅(Geum aleppicum)，植物經(jīng)陰干后粉碎備用;蘆丁(批號(hào)100080-200707，中國藥品生物制品鑒定所);蒸餾水;乙醇，分析純。

UV-2102PCS 型紫外可見分光光度計(jì);RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;BP211D 天平。

1.2 分析方法［7］

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，加入70%乙醇溶解并定容，制成0.234 mg/mL的對(duì)照品溶液，放置4 ℃保存。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密取對(duì)照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL 于25 mL 容量瓶中，分別加70%乙醇5 mL。精密加入5% NaNO2溶液0. 3 mL，搖勻，放置5 min。精密加入 10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，放置5 min。再加4%NaOH 溶液4 mL，分別用70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置5 min。在520 nm 處測定吸光度，以蘆丁溶液濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸得方程Y = 20. 012 7X－0.010 11，r2=0.999 3(n=6)，說明線性關(guān)系良好。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法［8］

稱取藥材10 g，置于500 mL 圓底燒瓶中，加入70%乙醇100 mL 提取1 h，測定總黃酮含量。

1.4 總黃酮含量測定

回收提取液中的乙醇，水浴蒸干，精密稱取殘?jiān)?0 mg，置于100 mL 容量瓶中，加70%乙醇超聲處理30 min，取出，冷卻，用70%乙醇定容，搖勻。在520 nm 處測定吸光度，并計(jì)算總黃酮含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮含量的影響

按1.3 條件實(shí)驗(yàn)，乙醇濃度的影響見圖1，70%乙醇提取時(shí)總黃酮含量最大。

圖1 乙醇濃度對(duì)總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavones

2.2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

稱取藥材4 份，每份10 g，分別置于500 mL 圓底燒瓶中，加入60%乙醇100 mL 進(jìn)行提取，測定總黃酮含量，結(jié)果見圖2。提取時(shí)間為2.5 h 時(shí)總黃酮含量最大。

圖2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of time on the yield of total flavones

2.3 溶劑用量對(duì)總黃酮含量的影響

分別稱取藥材5 份，每份10 g，分別置于500 mL圓底燒瓶中，加入60%乙醇，提取時(shí)間1 h，測定總黃酮含量，結(jié)果見圖3。溶劑用量為10 倍時(shí)總黃酮含量最大。

圖3 溶劑用量對(duì)總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of volume on the yield of total flavones

2.4 提取次數(shù)對(duì)總黃酮含量的影響

分別稱取藥材5 份，每份10 g，分別置于500 mL圓底燒瓶中，加入60%乙醇100 mL 提取1 h，測定總黃酮含量，結(jié)果見圖4。提取3 次時(shí)總黃酮含量最大。

圖4 提取次數(shù)對(duì)總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of times on the yield of total flavones

2.5 正交實(shí)驗(yàn)［9］

根據(jù)單因素考察結(jié)果，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，因素水平見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of L9(34)orthogonal test

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

由表2 可知，各因素對(duì)總黃酮含量的影響程度依次為B(提取次數(shù))＞C(提取時(shí)間)＞D(溶劑用量)＞A(乙醇濃度)，各因素對(duì)干膏得率的影響程度依次為B(提取次數(shù))＞D(溶劑用量)＞A(乙醇濃度)＞C(提取時(shí)間)。由表3 可知，提取次數(shù)(B)對(duì)總黃酮和干膏得率有顯著性影響(P ＜0.05)，且提取次數(shù)的第3 水平均較第1、2 水平更優(yōu)，故選用B3。溶劑用量(D)對(duì)干膏得率有顯著性影響(P ＜0.05)，且溶劑用量的第2 水平較第1、3 水平更優(yōu)，故選擇D2。乙醇濃度(A)和提取時(shí)間(C)對(duì)總黃酮和干膏得率均無顯著性影響，出于節(jié)省考慮，選擇A1C1。綜上所述，確定最佳提取工藝為A1B3C1D2，即10 倍量的60%乙醇提取3 次，每次2 h。

按照上述最佳提取工藝進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。

由表4 可知，總黃酮平均含量為6.58 mg/g，高于正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最大值，干膏得率平均值18.83%，與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最大值相當(dāng)，說明最佳工藝合理可行。

3 結(jié)論

采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)水楊梅中黃酮類化學(xué)成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，確定最佳提取工藝為10 倍量的60% 乙醇提取3 次，每次2 h。為水楊梅中黃酮類化合物的利用與開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

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