高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定槐花中蘆丁、槲皮素和山柰酚的含量

夏虹，彭茂民

(農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，湖北武漢 430064)

槐花為豆科植物槐的干燥花及花蕾，前者稱(chēng)“槐花”，后者稱(chēng)“槐米”，具有涼血止血、清肝瀉火的功效［1］。槐花中所含蘆丁、槲皮素、山柰酚等黃酮類(lèi)物質(zhì)為其主要有效成分，現(xiàn)代研究認(rèn)為蘆丁具有降低毛細(xì)血管的異常通透性和脆性的作用，是心血管疾病制劑的主要成分;槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗過(guò)敏、抗菌、抗病毒等作用［2］;山柰酚具有抗癲癇、抗?jié)儭⒔獐d、利尿、止咳的功效。

2010 版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)規(guī)定，槐花中總黃酮含量以蘆丁計(jì)，不得少于8.0%，蘆丁含量不得少于6.0%，藥典中沒(méi)有對(duì)其它黃酮類(lèi)成分進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定槐花中的蘆丁、槲皮素、山柰酚的含量，并且探討了兩種提取方式下3 種黃酮類(lèi)物質(zhì)的組成，因此可以更準(zhǔn)確地反映出槐花的品質(zhì)，為槐花藥材的加工、利用和質(zhì)量提供了科學(xué)的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

槐花，產(chǎn)地湖北恩施;蘆丁(Rutin)、槲皮素(QCT)、山柰酚(KFL)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;甲醇，色譜純;鹽酸、磷酸均為分析純;水為Millipore 超純水。

Alliance2695 高效液相色譜儀;2998 二極管陣列檢測(cè)器;Empower2 色譜工作站;KQ-250B 型超聲波清洗器。

1.2 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18柱(250 mm ×4. 6 mm i.d，5 μm);流動(dòng)相為0. 4% 磷酸水溶液∶甲醇=65∶35;流速1. 0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm;進(jìn)樣量10 μL。

1.3 樣品處理

1.3.1 酸水解法試樣溶液的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取槐花粉末約0.5 g(精確至0.1 mg)，置于250 mL 平底燒瓶中，加入40 mL 甲醇，6 mol/L 鹽酸溶液10 mL，加熱回流2.0 h。冷卻，過(guò)濾于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻。吸取1.00 mL 溶液，放入25 mL 容量瓶中，用甲醇定容，經(jīng)0. 45 μm 濾膜過(guò)濾。進(jìn)樣10 μL，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量。

1.3.2 超聲提取法溶液的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取槐花粉末約0.5 g(精確至0.1 mg)，加入50 mL 甲醇，超聲60 min，冷卻，過(guò)濾于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻。吸取1.00 mL 溶液，放入25 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻。經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣10 μL，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

蘆丁、槲皮素、山柰酚黃酮類(lèi)化合物屬于黃酮醇類(lèi)物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是在黃酮基本母核——2-苯基色原酮的3 位上連有羥基或其他含氧基團(tuán)，此類(lèi)化合物有較強(qiáng)的紫外吸收。用二極管陣列檢測(cè)器采集200 ～400 nm 的色譜圖，發(fā)現(xiàn)蘆丁在256 nm 和353 nm 處、槲皮素在254 nm 和370 nm 處、山柰酚266 nm 和367 nm 處均有較強(qiáng)吸收。綜合各組分的最大吸收波長(zhǎng)，確定360 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，可獲得高的靈敏度和較少的干擾。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁、槲皮素、山柰酚對(duì)照品各10 mg，置于50 mL 容量瓶中，超聲溶解，用甲醇定容，配制成200 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。再準(zhǔn)確吸取0.5，1.0，2.0，4.0，5.0 mL，用流動(dòng)相定容至10 mL，此標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為10，20，40，80，100 μg/mL，在上述液相條件下分別進(jìn)樣10 μL。以各組分的濃度X(μg/mL)與峰面積Y 作圖，線(xiàn)性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

蘆丁y=1.62 ×104x－8.60 ×103，γ=0.999 9

槲皮素y=3.03×104x+2.19×104，γ=0.999 7

山柰酚y=4.04×104x+3.86×104，γ=0.999 9

圖1 混合標(biāo)樣圖Fig.1 Chromatogram of the three flavonoids

2.3 槐花中蘆丁、槲皮素、山柰酚的測(cè)定

在上述樣品處理及儀器條件下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2，圖3 和表1。

圖2 酸水解法樣品圖Fig.2 The sample chromatogram of acid hydrolysis method

圖3 超聲提取法樣品圖Fig.3 The sample chromatogram of ultrasonic extraction method

表1 測(cè)定結(jié)果Table 1 The determination results of different extraction method

由表1 可知，蘆丁在酸的作用下，水解成槲皮素［3］。槐花中主要含有蘆丁，還含有少量的槲皮素和山柰酚;槐花樣品經(jīng)酸水解后檢測(cè)不出蘆丁，但槲皮素的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于超聲提取所得的槲皮素含量。

2.4 加標(biāo)回收及精密度

準(zhǔn)確稱(chēng)取已知含量(蘆丁8. 28 mg/g、槲皮素5.7 mg/g、山柰酚1.3 mg/g)的槐花樣品5 份，分別精確加入一定量的蘆丁、槲皮素、山柰酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入50 mL 甲醇超聲60 min，冷卻，過(guò)濾于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻。分別進(jìn)樣10 μL，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of recovery tests

由表2 可知，蘆丁平均回收率為99.2%，RSD為2.59%;槲皮素平均回收率為97. 4%，RSD 為3.32%;山柰酚平均回收率為93. 6%，RSD 為2.67%。

3 結(jié)論

建立了RP-HPLC 法測(cè)定槐花中的蘆丁、槲皮素、山柰酚的含量，方法簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確可靠，回收率在93.6% ～99.2%。本方法對(duì)槐花的提取條件進(jìn)行較全面的摸索，為評(píng)價(jià)和控制槐花的質(zhì)量提供了一個(gè)可靠的方法。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典:一部［S］. 北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:945-946.

［2］ 朱軼姮，趙鴻雁，羅賢標(biāo)，等. 反相高效液相色譜法測(cè)定槐米中槲皮素的含量［J］. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24(5):551-552.

［3］ 邊清泉.HPLC 法測(cè)定涼山杜鵑花中蘆丁、槲皮素的含量［J］.西南科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，19(4):83-85.