非標記適體-金納米檢測尿中痕量腺苷

趙慧，王愛芝，王永生

(南華大學 公共衛生學院，湖南 衡陽 421001)

研究表明，腫瘤細胞的快速增殖可導致腺嘌呤核苷酸降解，使腺苷的產生和排出增多，尿中腺苷可以作為潛在的腫瘤標志物［1-2］。因此，檢測尿液中腺苷含量對惡性腫瘤早期診斷、預后監測等方面具有重要意義。

目前測定尿中痕量腺苷的方法有高效液相色譜法［3］、毛細管電泳法［4］、液相色譜-質譜聯用法［5］、共振光散射法［6］、熒光分光光度法［7］等，這些方法雖然各有優點，但都存在或多或少的不足。

本文基于腺苷與未標記的腺苷適體特異性結合，金納米不被腺苷適體保護而在高鹽濃度下聚集，導致共振光散射增強的原理，建立RLS 測定腺苷的新方法，已用于尿樣中腺苷的測定。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

腺苷、氯金酸、檸檬酸三鈉、氯化鈉等均為分析純;腺苷適體為色譜純(序列號為5'-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3'，臨用前需95 ℃5 min處理后，緩慢冷卻至室溫);實驗用水為滅菌雙蒸水;金納米，按參考文獻［8］制備。

F-4500 熒光分光光度計;UV-2550 紫外-可見分光光度計;AB204-S 電子分析天平;PB-21 型精密酸度計。

1.2 實驗方法

于2 mL EP 管中依次加入pH 4.6 BR 緩沖溶液35 μL，1.0 μmol/L 腺苷適體20 μL 和不同體積的1.0 ×10－10mol/L 腺苷溶液，漩渦混勻，于37 ℃恒溫水浴箱中孵育30 min。加入金納米粒子40 μL，加入適量滅菌雙蒸水，混勻，室溫孵育25 min。加入0.5 mol/L NaCl 溶液50 μL，混勻后立即在熒光分光光度計上以λex=λem進行同步掃描，獲取RLS 光譜，記錄λmax=540 nm 處溶液RLS 強度(I)和試劑空白RLS 強度(I0)，計算ΔI=I－I0。激發和發射狹縫寬度分別為5.0，10.0 nm，光電倍增管電壓為400 V。同時在紫外-可見分光光度計上掃描吸收光譜。

2 結果與討論

2.1 光譜特征

圖1 為適體-AuNPs-腺苷體系的吸收光譜圖和RLS 圖譜。

圖1 適體-AuNPs-腺苷體系的吸收光譜(1)和RLS 光譜(2)Fig.1 Absorption and RLS spectra of aptamer-AuNPs-adenosine system

由圖1 可知，適體-AuNPs-腺苷體系的最大RLS峰位于540 nm，處于體系的最大吸收峰附近。由于RLS 作用包括散射-吸收-再散射過程，根據Miller、Anglister 和Steinberg 的RLS 理論，體系增強的散射光譜可以認為是共振光散射。

圖2 為適體-AuNPs-腺苷體系在pH 4.6 BR 緩沖液中的RLS 圖譜。

由圖2 可知，在pH 4.6 BR 緩沖液中，單獨的AuNPs 的RLS 強度很弱(圖2a)，加入NaCl 溶液之后，AuNPs 在高鹽溶液中發生聚集，體系的RLS 強度顯著增強(圖2b)。在AuNPs 溶液中加入腺苷適體，再加入NaCl 后，AuNPs 被腺苷適體保護，體系的RLS 強度減弱(圖2c)。在適體-AuNPs 復合物中加入腺苷，腺苷與腺苷適體特異性結合，金納米不被腺苷適體保護而在高鹽濃度下聚集，體系的RLS 強度增強(圖2d)，且隨著腺苷濃度增加，體系的RLS 依次增強，在λmax=540 nm 處，腺苷濃度與ΔI 在一定范圍內呈良好線性關系。

圖2 適體-AuNPs-腺苷體系的RLS 光譜Fig.2 RLS spectra of aptamer-AuNPs-adenosine system

2.2 實驗條件的優化

2.2.1 體系酸度及用量的影響 選用PBS、MES 和BR 3 種緩沖溶液進行實驗，結果表明，在BR 緩沖液中，體系的RLS 強度的變化值最大。在BR 緩沖液中，隨著pH 增加，ΔI 值也不斷的上升，在pH 4.4～4.8 范圍內相對穩定，且在pH 4.6 時，ΔI 值最大，故本實驗選擇pH 4.6 的BR 緩沖溶液35 μL 控制體系的酸度。

2.2.2 AuNPs 用量的影響 實驗了AuNPs 用量對體系ΔI 值的影響。結果表明，當AuNPs 用量在25～40 μL 時，體系的ΔI 值逐漸增大;繼續增加AuNPs 用量，體系的ΔI 值降低。因此，本實驗選擇AuNPs 的用量為40 μL。

2.2.3 NaCl 用量的影響 固定已優化的實驗條件，探討了0.5 mol/L NaCl 溶液的用量對反應體系的影響。結果表明，隨著NaCl 溶液用量增加，體系ΔI 值不斷變大，NaCl 溶液用量為50 μL 時，ΔI 達到最大值。因此，本實驗選擇適體用量為50 μL。

2.2.4 反應時間的影響 研究了反應時間在5 ～60 min 范圍內體系的RLS 強度的變化。實驗表明，反應25 min 時，體系的ΔI 達到最大值，隨著時間繼續增加，體系的ΔI 值恒定不變，體系的穩定性良好。故本實驗選擇反應時間為25 min。

2.3 干擾實驗

在最佳實驗條件下，腺苷濃度為1.5×10－11mol/L，實驗了可能共存的多種離子或物質對體系的影響。結果表明，當相對標準偏差≤5%時，1 000 倍的葡萄糖;260 倍的尿素;223 倍的;200 倍的Na+、K+、Ag+、Cl－、NO3－;100 倍的Pb2+、Hg2+、Al3+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、、F－、Br－、;82 倍的草酸;67 倍的EDTA 二鈉、Zn2+、Fe3+、Ba2+、尿苷、胸苷;47 倍的鳥苷;45 倍的I－、Cu2+;9 倍的胞苷等對測定沒有影響，可見該法有較好的選擇性。

2.4 標準曲線、檢出限及精密度

按照實驗方法，加入不同體積腺苷標準溶液，繪制標準曲線。結果表明，腺苷的濃度在1.9 ×10－12～2.0×10－11mol/L 范圍內，與體系ΔI 有良好的線性關系，其回歸方程為ΔI =71.3 +17.0c(×10－12mol/L)，相關系數r=0.994 8。根據11 次空白樣品的平行測定，按公式LOD=3Sb/k(Sb和k 分別為空白管的標準差和直線回歸方程的斜率)計算，可得本方法的檢出限為5.7 ×10－13mol/L。平行配制11 管濃度分別為1.0 ×10－12，1.5 ×10－11，2.0 ×10－11mol/L的腺苷標準溶液進行精密度實驗。結果相對標準偏差(RSD)分別為1.48%，3.70%和2.52%。

2.5 樣品分析

采集南華大學學生尿樣1 和南華大學附屬第一醫院糖尿病病人尿樣2 和腦梗阻病人尿樣3 各1 mL，以3 500 r/min 的 速 度 離 心10 min，用0.22 μm 針頭式過濾器過濾，取上清液，按實驗方法進行操作，測定樣品中的腺苷含量和加標回收率，結果見表1。

表1 樣品中腺苷檢測結果(n=6)Table 1 Determination results of adenosine in the samples(n=6)

3 結論

在優化的實驗條件下，腺苷與腺苷適體特異性結合，AuNPs 失去適體的保護而聚集，導致體系的RLS 強度顯著增強，且在一定的濃度范圍內，體系的ΔI 與腺苷的濃度有良好的線性關系，據此建立了尿樣中痕量腺苷的檢測新方法。本方法應用于實際尿樣中腺苷的檢測，簡單、快速、選擇性好、檢出限低。

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