正交實驗法優選黃連中鹽酸小檗堿醇提工藝的研究

陳程

(西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021)

黃連為毛莨科植物黃連的干燥根莖［1］。鹽酸小檗堿為黃連中含量最高的原小檗堿型生物堿，也是最重要的活性成分之一，具有抗炎、抗菌、抗癌，治療糖尿病和心血管疾病，及抑制脂肪分化等多方面藥理作用［2-3］。鹽酸小檗堿是一種季銨生物堿，其鹽類在水中溶解度低，水提不能達到很好的提取效果［4］。故本研究選用乙醇回流提取。

以鹽酸小檗堿含量和干膏得率作為評價指標，采用正交實驗法優選最佳醇提工藝。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

黃連飲片，經西安醫學院生藥教研室鑒定為毛茛科植物黃連的干燥根莖;鹽酸小檗堿(批號110733-200806);乙腈、甲醇均為色譜純;水為雙蒸餾水;乙醇、鹽酸均為分析純。

Waters 2695 高效液相色譜儀，Waters 2695 泵，Waters 2996 二極管陣列檢測器，Empower2 色譜工作站;Fw-200 高速萬能粉碎機;RE-52-05 旋轉蒸發儀;梅特勒GB204 電子天平(萬分之一)。

1.2 實驗方法

稱取黃連藥材9 份，每份10 g，分別按L9(34)正交表安排的方案進行提取，提取液備用。測定并計算鹽酸小檗堿含量和干膏得率。正交實驗因素水平見表1。

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

1.3 鹽酸小檗堿HPLC 法檢測

1.3.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀 溶 液(50 ∶50，pH 調 為4. 0)，檢 測 波 長345 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃。

1.3.2 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含10 μg 的溶液。

1.3.3 供試品溶液制備 分別精密移取0.1 mL 提取液，置于蒸發皿中，水浴蒸干。用甲醇溶解至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，過濾，取續濾液，即得。

1.3.4 標準曲線繪制 精密吸取對照品溶液2，5，10，15，20 μL 進樣，測定峰面積。以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標作圖，線性回歸，得標準曲線方程，y=156 548x+27 954，R2=0.999 6。表明鹽酸小檗堿在進樣量0.02 ～0.2 μg 內，線性關系良好。

1.3.5 樣品含量測定 分別注入對照品溶液和供試品溶液各10 μL 于液相色譜儀中，計算鹽酸小檗堿含量。

1.4 干膏得率的測定

精密量取提取液5 mL，置蒸發皿中水浴蒸干，減壓干燥，精密稱定質量，計算干膏得率。

2 結果與討論

2.1 正交實驗結果

正交實驗結果見表2，方差分析見表3。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal test

由表2 可知，各因素的影響次序依次為C ＞D ＞B ＞A，即溶劑用量＞提取次數＞提取時間＞乙醇濃度。方差分析結果表明，C(溶劑用量)因素有顯著性影響(P ＜0.05)。從實際工業生產考慮，選定最佳工藝條件為A1B1C3D3，即50%乙醇提取3 次，每次提取時間1.5 h，3 次加醇量分別為8，6，6 倍。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.2 驗證實驗

按照正交實驗優選出的最佳工藝條件重復3次，以驗證該提取工藝條件是否具有重現性，結果見表4。結果表明該提取工藝穩定、可行。

表4 驗證實驗結果(n=3)Table 4 Verification experiment results(n=3)

2.3 分析方法的方法學考察

2.3.1 精密度 精密吸取對照品溶液10 μL 進樣，重復進樣5 次，測定鹽酸小檗堿峰面積積分值。結果RSD 值為1.01%。

2.3.2 穩定性 精密吸取供試品溶液，于12 h 內測定，結果鹽酸小檗堿峰面積RSD 值為0.55%，供試品溶液在0 ～12 h 內基本穩定。

2.3.3 重復性 取同一批的黃連藥材5 份，制備5份供試品溶液，測定并計算鹽酸小檗堿峰面積的RSD 值為1.37%，重復性良好。

2.3.4 加樣回收率 精密移取6 份已知含量的樣品0. 05 mL，置蒸發皿中，分別精密加入相當0.05 mL 樣品溶液80%，100%，120%的鹽酸小檗堿對照品溶液，按照供試品溶液制備方法和色譜條件測定，測得平均回收率為99.73%，RSD 為1.01%。結果表明，本方法回收率良好。

3 結論

(1)黃連中鹽酸小檗堿的醇提最佳工藝條件為:50%乙醇提取3 次，每次提取時間1.5 h，3 次加醇量分別8，6，6 倍。該醇提工藝重現性和穩定性良好。

(2)用HPLC 法測定黃連中鹽酸小檗堿含量，該方法分離較好，穩定可行。

［1］ 鄭漢臣.藥用植物與生藥學［M］.北京:人民衛生出版社，2006.

［2］ 崔學軍.小檗堿的藥理學研究進展及臨床新用途［J］.時珍國醫國藥，2006，17(7):1311-1312.

［3］ Niu Lingying，Qiao Wei，Hu Zhendong，et al.Berberine attenuates lipopolysaccharide induced impairments of intestinal glutamine transport and glutaminase activity in rat［J］.Fitoterapia，2011，82(3):323-330.

［4］ 徐媛.正交試驗法優選黃連中小檗堿提取工藝［J］.中國中醫藥信息雜志，2011，18(5):60-61.