馬蘭葉總黃酮的提取及其含量的測定

顧霞敏，許海丹，梁丹霞

(臺州學院 醫藥化工學院，浙江 臨海 317000)

馬蘭［Kalimeris indica (Linn.)Sch.］為菊科馬蘭屬多年生草本植物，中國南方各地有分布。在我國，部分地區馬蘭作為草本花卉栽培，是兼有食用、藥用的多用經濟植物。馬蘭中營養豐富，含有氨基酸、黃酮、多糖、礦物質等多種營養成分［1-2］，具有鎮痛、抗炎等功效［3］。黃酮類化合物具有抗氧化、抗病毒、增強人體免疫能力等［4-5］多種生物活性。目前，國內外對馬蘭黃酮化合物的研究報道相對還較少，報道中，馬蘭總黃酮含量的測定多為NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 體系的紫外分光光度法［6-9］，該法存在顯色繁瑣、操作復雜、檢測時間長等不足。

本實驗建立AlCl3顯色法測定馬蘭葉總黃酮的含量，并以黃酮提取率為考察指標，優化馬蘭葉總黃酮的超聲提取工藝，從而為馬蘭總黃酮進一步開發提供指導。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

新鮮馬蘭葉;蘆丁標準品(批號100080-200707)，來自中國藥品食品檢定研究院;甲醇、乙醇、石油醚(60 ～90 ℃)、AlCl3·6H2O 均為分析純。

UV-2401PC 島津紫外分光光度計;中草藥粉碎機;RE-52AA 旋轉蒸發器;KQ-500DE 型醫用數控超聲波清洗器。

1.2 馬蘭葉的預處理

新鮮馬蘭葉用清水洗凈，105 ℃殺青20 min，80 ℃下真空干燥至恒重，粉碎過60 目篩。將干燥粉末分批于索氏提取器中，用石油醚脫脂處理。脫脂后，揮去石油醚，即為馬蘭葉脫脂粉末，脫脂粉末質量約占原干燥粉末60%。將脫脂粉末保存于干燥器中，備用。

1.3 溶液制備

1.3.1 蘆丁標準溶液的配制 精密稱取于120 ℃干燥至恒重的蘆丁50. 0 mg，加甲醇適量，超聲溶解，放冷，用甲醇定容至50 mL，即為1 mg/mL 的蘆丁標準溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備 稱取馬蘭葉脫脂粉末1.0 g 于錐形瓶中，加90%乙醇50 mL，70 ℃超聲提取2 次，每次40 min［10］。抽濾，合并兩次濾液，減壓濃縮除去溶劑，用甲醇溶解，并定容至25 mL。

1.4 馬蘭葉總黃酮含量的測定

移取一定量的蘆丁標準溶液或樣品溶液于10 mL 容量瓶中，加入1%AlCl3-甲醇溶液2 mL，用甲醇稀釋至刻度。搖勻、顯色15 min 后，以空白試劑作參比，在418 nm 波長處讀取吸光度。

1.5 馬蘭葉總黃酮的提取

稱取1.0 g 馬蘭葉脫脂粉末于錐形瓶中，加入試劑浸泡30 min，使粉末充分浸潤，進行超聲提取。提取液減壓濃縮除去溶劑，用甲醇溶解并定容至25 mL。馬蘭葉總黃酮提取率按下式計算:

2 結果與討論

2.1 馬蘭葉總黃酮含量的測定方法

2.1.1 檢測波長的選擇 分別移取1 mL 的蘆丁標準溶液和樣品溶液，按實驗方法顯色15 min 后，在300 ～600 nm 進行掃描，見圖1。

圖1 蘆丁與樣品溶液吸收譜圖Fig.1 Absorption spectra of rutin and sample solution 1.蘆丁標準溶液;2.樣品溶液

由圖1 可知，確定檢測波長為418 nm。

2.1.2 顯色劑用量的確定 按實驗方法分別取蘆丁標準溶液與樣品溶液各1 mL，分別加入顯色劑1% AlCl3-甲醇溶液0 ～9 mL(間隔1 mL)，用甲醇定容至10 mL，在418 nm 處測定吸光度值。結果表明，在0 ～2 mL，吸光度值隨顯色劑用量的增加而顯著增加，2 ～9 mL 吸光度值變化幅度不大。因此，確定顯色劑用量為2 mL。

2.1.3 顯色時間的選擇 各取標準溶液與樣品溶液1 mL，加入2 mL 顯色劑，甲醇定容至10 mL。每隔1 min 在418 nm 處測定吸光度。結果表明，樣品溶液與標準溶液，顯色15 min 后，吸光度幾乎維持穩定。

2.1.4 線性關系 把蘆丁標準溶液稀釋成表1 中的濃度，按實驗方法，取1 mL 檢測吸光度。以吸光度A 為縱坐標，濃度C 為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為:A =17.355C +0.002 1，R2=0.998 6，表明濃度在0.004 ～0.100 mg/mL，有良好的線性關系。

表1 蘆丁標準溶液濃度與吸光度Table 1 Rutin standard solution concentration and absorbency

2.1.5 方法學驗證

2.1.5.1 精密度 取樣品溶液5 份，按上述實驗確定的參數測定吸光度，得RSD =0.487%，表明該方法精密度良好。

2.1.5.2 穩定性 取1 份樣品溶液，顯色15 min后，分別測定在0 ～90 min(間隔10 min)內吸光度。RSD=0.407%，表明該顯色反應至少在90 min 內是穩定的。

2.1.5.3 重復性 對同一批馬蘭葉脫脂粉末5 份，按上述方法提取、分析，得RSD =2.07%，說明該方法重復性良好。

2.1.5.4 加樣回收率 取5 份樣品溶液各1 mL，分別添加已知含量的蘆丁標準溶液，測定總黃酮量。得平均加樣回收率為97.4%，RSD=0.96%。

2.2 馬蘭葉總黃酮超聲提取工藝優化

2.2.1 正交實驗結果 因素水平見表2，結果見表3。由表3 可知，影響馬蘭葉總黃酮超聲提取的主次順序為:A(提取溫度)＞C(乙醇體積分數)＞B(提取時間)＞D(料液比)，最佳方案為A3B3C2D2，即提取溫度50 ℃，提取50 min，乙醇體積分數80%，料液比1/50(g/mL)。

表2 正交因素水平Table 2 Factors and levels of the orthogonal design

表3 正交實驗結果Table 3 Orthogonal experimental results

2.2.2 優選條件的驗證 在最佳條件下超聲提取馬蘭葉總黃酮，平行操作3 次，平均提取率為7.01%，RSD =1.64%?？梢夾3B3C2D2條件下，黃酮提取率均高于表3 中的每項實驗結果，該條件為最佳選擇。

3 結論

(1)建立了以1% AlCl3-甲醇溶液為單一顯色劑，紫外分光光度法快速測定馬蘭葉總黃酮含量的方法，該方法簡便、結果可靠。

(2)馬蘭葉總黃酮的超聲提取最優條件為:乙醇體積分數80% 提取，料液比1 ∶50(g/mL)，在50 ℃提取50 min。在此條件下，總黃酮的提取率為7.01%。

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