有機氯農藥與牛血清白蛋白作用機理研究

李慧芳

(煙臺大學 文經學院，山東 煙臺 264005)

有機氯農藥(Organohlorine pestcides，OCPs)主要包括氯代脂環族碳氫化合物和氯代芳香族化合物。前者以六六六及其異構體、艾氏劑、狄氏劑及其異構體、氯丹及其異構體、七氯等為代表，后者以DDT 及其異構體、六氯苯等為代表。有機氯農藥結構較穩定，對富含脂肪的組織具有特殊親和力，在自然界不易降解，可通過生物富集作用蓄積于生物體內。有研究表明，有機氯農藥和血漿蛋白質能產生一定的結合作用［1］，并可直接影響到藥物在生物體內的分布和消除［2-3］。且就我們所知，還未見有機氯和血漿蛋白結合作用機理的研究報道。

血漿中含有幾種轉運蛋白，但只有白蛋白與異源物親和性較強［4］。血清白蛋白作為脊椎動物血漿中最為豐富的蛋白質，在藥物分布和療效上起著重要的作用，并且藥物和白蛋白之間的作用可引起蛋白的構象改變［2，5-6］。迄今為止，與蛋白質的結合作用研究多集中于人血清白蛋白［4，7］、牛血清白蛋白［4，8］和魚血清白蛋白［9-10］等。本實驗選擇廉價易得的BSA 為例來研究OCPs 和蛋白質之間的結合作用。BSA 的氨基酸殘基在吸收了280 nm 波長的激發光后會發射出相應的熒光，當向血清白蛋白體系中加入一些小分子物質時則能引起氨基酸殘基的熒光猝滅。分子熒光光譜法可用來測量這種猝滅現象，從而推斷白蛋白和藥物之間的結合作用機理［4，7-10］。本文旨在利用分子熒光光譜法研究5 種有機氯農藥(δ-BHC、α-氯丹、HCB、Aldrin、o，p'-DDT)與BSA 之間的結合作用機理，推斷農藥小分子在動物體內的存在形態，與蛋白質結合能力的大小，為研究有機氯的毒理學提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

δ-BHC、α-氯丹、HCB、艾氏劑、o，p'-DDT 等5 種有機氯農藥均為工業品，純度97.0% ～99.0%;牛血清白蛋白(BSA)，購于北京軍區獸醫防治中心生物工程研究室，純度＞98%。

Cary Eclipse 熒光分光光度計，配有恒溫裝置和1.00 cm 石英比色池。

1.2 試液配制

牛血清白蛋白用pH 為7.4 的Tris-HCl 緩沖溶液配制為1 μmol/L 的標準溶液。5 種有機氯類農藥分別用正己烷配制成一定濃度的單標溶液，于－20 ℃保存備用;然后α-氯丹、δ-六六六、艾氏劑、o，p'-DDT 和六氯苯分別用甲醇配制成濃度為2.44×10－7，2.85 ×10－6，1.48 ×10－4，1.41 ×10－4，3.51×10－4mol/L 的工作液。

1.3 熒光光譜分析

比色池中加入3 mL 牛血清標準溶液，待恒溫后，用可調式微量注射器向石英比色池中依次加入5，10，15……45，50 μL 的OCPs 溶液，磁力攪拌混勻。在測定光譜通帶Δλ =5 nm、激發波長λex=280 nm、發射波長λmx=345 nm 條件下，分別掃描25，37 ℃下不同OCPs-BSA 體系的熒光光譜。

2 結果與討論

2.1 OCPs 猝滅BSA 的熒光光譜

圖1 25 ℃和37 ℃下α-氯丹對BSA 的猝滅譜圖Fig.1 Effect of α-chlordane on fluorescence spectra of BSA at 25 ℃and 37 ℃

280 nm 波長激發下，BSA 溶液能發出熒光，主要歸結于色氨酸殘基［11］。從色氨酸發射光譜的變化可推測蛋白質的構象改變、亞基締合、底物結合或者變性現象［11-12］。所以，蛋白質的固有熒光可提供有關結構和動力學信息，以研究蛋白質的折疊和結合反應［4］。實驗選取了α-氯丹、δ-六六六、艾氏劑、o，p'-DDT 和六氯苯這5 種極性不同的OCPs 作為代表，研究有機氯與蛋白質的結合作用。在BSA 濃度不變的情況下，隨著OCPs 濃度的增加，BSA 的熒光峰位及峰形基本保持不變，但其熒光強度卻有規律地降低，這表明該類農藥和BSA 之間存在相互作用。25 ℃和37 ℃時OCPs 對BSA 的猝滅譜圖分別見圖1(以α-氯丹為代表)。

2.2 OCPs 對BSA 的猝滅類型

熒光猝滅可分為動態猝滅和靜態猝滅，前者是指處于激發態的熒光物質與猝滅劑發生碰撞后能量損失，從而在返回基態時沒有熒光產生;后者是指熒光物質在基態與猝滅劑形成不發熒光的締合物［4］。動態猝滅通常符合Srern-Volmer 方程，靜態猝滅過程只有在猝滅劑與熒光物質之間形成1∶1 配合物時才符合該方程［11］:

式中，F0為不存在猝滅劑時BSA 的熒光強度;F 為猝滅劑加入后BSA 的熒光強度;Kq為雙分子猝滅過程速率常數(當Kq＞1012，一般為靜態猝滅過程);τ0為不存在猝滅劑時測得的熒光壽命(τ0≈10－8s);KSV為Stern-Volmer 猝滅常數;［Q］為OCPs 濃度。

實驗分別測定25 ℃及37 ℃下BSA 的熒光強度F0/F 隨OCPs 濃度的變化，并利用Stern-Volmer擬合曲線表明，BSA 的熒光強度比值F0/F 與5 種OCPs 濃度呈良好的線性關系(見圖2)。BSA 與5種OCPs 的Stern-Volmer 擬 合 方 程、KSV和Kq列于表1。

表1 BSA 與5 種OCPs 藥物的Stern-Volmer 回歸方程及猝滅常數Table 1 Stern-Volmer equations and quenching constants of OCPs on BSA

由表1 可知，5 種OCPs 的Kq均大于1012，故可以 推斷5 種OCPs 猝滅BSA 的過程均為靜態猝滅過程。

圖2 25 ℃和37 ℃下5 種OCPs 藥物對BSA 的Stern-Volmer 曲線圖Fig.2 Stern-Volmer plots of BSA titrated against 5 OCPs at 25 ℃and 37 ℃

2.3 結合常數和結合點位數

對于靜態猝滅，熒光強度與猝滅劑濃度之間遵循以下關系式［13-14］:

式中，F0為未加藥物時BSA 的熒光強度，F 表示藥物濃度為［Q］時BSA 的熒光強度，K 為結合常數，n為結合位點數，即一個BSA 分子可結合的藥物分子的數目。改變OCPs 的藥物濃度，BSA 的熒光強度將發生變化，將log［(F0－F)/F］對log［Q］作圖，得到了良好的線性關系(見圖3)，然后可通過斜率和截距求出藥物小分子與蛋白質分子的結合常數K及結合位點數n。5 種OCPs 與BSA 的結合常數K及結合位點數n 見表2。

由表2 可知，5 種OCPs 與BSA 的結合常數大小順序為α-氯丹＞δ-BHC ＞艾氏劑＞o，p'-DDT ＞HCB，說明5 種農藥中α-氯丹結合BSA 的能力相對最強，HCB 結合BSA 的能力最弱;5 種OCPs 與BSA的結合點位數都近似為1，說明一個BSA 分子可結合一個有機氯分子。當溫度從25 ℃提高到37 ℃，結合常數也隨之增加，說明適當增加溫度有助于BSA 與OCPs 的結合。

圖3 log ［(F0－F)/F］與log［Q］關系曲線Fig.3 Plots of log［(F0－F)/F］vs log［Q］at 25 ℃and 37 ℃

表2 OCPs 與BSA 作用的平衡常數K0和結合點位數nTable 2 The equilibrium constants K0 and binding sites n of BSA-OCPs systems

2.4 OCPs 和BSA 作用力的確定

由不同溫度下的K 值，利用van’t Hoff 方程［式(3)和式(4)］，可獲得OCPs 與BSA 相互作用的焓變ΔH、自由能變ΔG 和熵變ΔS(見表3)。

藥物小分子與生物大分子間的作用力包括氫鍵、范德華力、疏水作用力和靜電引力等非共價作用力。根據反應的熱力學常數可大致確定作用力類型［15］:ΔH ＞0，ΔS ＞0，主要表現為疏水作用力;ΔH ＜0，ΔS ＜0 時，主要表現為氫鍵和范德華力;ΔH≈0，ΔS ＞0，主要表現為靜電引力。

由表3 可推斷，25 ℃和37 ℃時，對于δ-BHC、α-氯丹、艾氏劑、o，p'-DDT、HCB 這5 種POPs 農藥，ΔH ＞0，ΔS ＞0，說明5 種OCPs 與BSA 之間的相互作用主要表現為一個熵增加、以疏水作用力為主的過程。

表3 OCPs 與BSA 作用的熱力學參數Table 3 The thermodynamic parameters of the BSA-OCPs procedures

3 結論

通過熒光光譜法測得5 種OCPs 均是較溫和的猝滅劑，對BSA 的熒光猝滅都屬于靜態猝滅，有機氯分子與蛋白質分子可通過較弱的疏水作用力1∶1相互結合，而且5 種OCPs 相對而言，α-氯丹的結合能力最強，HCB 的結合能力最弱;雖然不同的有機氯分子與蛋白質的結合強度有所不同，但都會隨著溫度的升高而加強。

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