長白山藥用真菌雞爪苓菌絲體全長cDNA文庫的初步構建

廖鏖，欒換東，李太元，李艷茹，許廣波(延邊大學農學院，吉林延吉133002)

雞爪苓是我國長白山區特有的野生豬苓(Polyponus umbellatus(Pers.)Fr)種屬，其菌核體形細長，分枝較多，表面多褶皺，形如雞爪［1－4］。XING 等［5］通過對產自不同地區豬苓菌核的nrDNA ITS和28S rRNA(LSU)序列進行比對分析后，提出雞爪苓與陜西等地所產豬苓的種內遺傳背景不同，應列為單獨類群。豬苓菌核是由大量菌絲體相互纏繞組成的休眠體，也是其藥用部位，具有利尿滲濕、免疫調節、抗腫瘤的作用［6－9］。目前，國內針對豬苓的研究主要集中于化學活性物質的分離純化、藥理活性的測定和遺傳分類等方面，有關豬苓分子生物學方面的研究較少，劉開輝等［10］通過rDNA，ITS(1，2)序列分析研究了不同地區豬苓的親緣關系，宋超等［11］克隆豬苓擬核cDNA，得到溶血素全長cDNA。

cDNA文庫即生物在某個發育時期內所轉錄的全部mRNA經反轉錄形成的cDNA片段與載體連接而形成的包含全部mRNA信息的cDNA克隆集合［12］，主要包括全長cDNA文庫、均一化cDNA文庫和消減cDNA文庫。全長cDNA文庫的構建、測序和功能注釋是了解生物體結構和功能的重要方法［13］。筆者采用SMART技術，MMLV－RT反轉錄酶作用微量總RNA，快速構建了雞爪苓菌絲體全長cDNA文庫，為研究雞爪苓生長分化的分子機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 雞爪苓菌絲體由采自長白山區野生雞爪苓菌核經組織分離后得到，菌株經純化后保存于延邊大學微生物學與免疫學教學實驗中心。

Trizol reagent購于Invitrogen公司，SMARTTMcDNA Library Construction Kit User Manual，Advantage 2 PCR Kit購于clontech公司，MaxPlaxTMLambda Packaging Extracts購于Epicentre公司。

1.2 方法

1.2.1 雞爪苓菌絲體總RNA的提取。取經純培養7、14、21、28 d的雞爪苓菌絲體，用液氮研磨成粉末(3次)，加入1 ml Trizol，按照Trizol reagent說明書提取雞爪苓菌絲體的總RNA，－80℃保存備用。

1.2.2 SMART法合成cDNA。加入總RNA、SMARTⅣ Oligonucleotide、CDS Ⅲ/3’PCR Primer，輕輕混勻后 72 ℃水浴 2 min，冰浴 2 min。再加入 5 × First-Strand Buffer、DTT、dNTP Mix、SMARTScribe MMLV RT，42 ℃水浴1 h，合成 First-Strand cDNA。取2 μl First-Strand cDNA至PCR管，加入去離子水、10 × Advantage 2 PCR buffer、50 × dNTP Mix、5'PCR Primer、CDSⅢ/3'PCR Primer和50×Advantage 2 Polymerase Mix。輕輕混勻后進行LD-PCR，反應條件:95℃ 1 min、95℃ 15 s、68℃ 6 min，22個循環，合成ds cDNA，4℃保存備用。

1.2.3 cDNA的純化與酶切。將PCR產物用Proteinase K消化，酚仿抽提濃縮，用SfiⅠ酶切。采用CHROMA SPIN-400柱進行分級分離，收集單滴組分于16個離心管中，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分級分離結果，收集大于500 bp的基因片段組分，用醋酸鈉、糖原和95%乙醇濃縮，溶解于7 μl去離子水中，－20℃保存備用。

1.2.4 λTripIEx2 載體的連接。分別取0.5、1.0 μl cDNA 與1 μl λTripIEx混合，加入T4連接酶，16℃過夜。混合2管連接產物，包裝蛋白MaxPlaxTMLambda Packaging Extracts包裝連接產物，加入600 μl噬菌體稀釋緩沖液，25 μl氯仿，振蕩混勻，去沉淀，即為原始文庫。

1.2.5 原始文庫的檢測。將原始文庫稀釋10倍后，取1、10 μl與200 μl XL1-Blue的菌懸液混合，37 ℃孵育15 min，再加入IPTG和X-Gal各50 μl，移至3 ml頂層瓊脂培養基，均勻傾倒于LB/MgSO4平板，37℃培養，檢測噬菌斑藍白斑數。

1.2.6 文庫的擴增及檢測。取10 μl原始文庫與500 μl XL1-Blue的菌懸液混勻，37℃孵育15 min，移至3 ml頂層瓊脂培養基，均勻傾倒于LB/MgSO4平板，37℃培養10 h，每個平板加10 ml噬菌體稀釋緩沖液，4℃過夜，室溫振蕩1 h后收集緩沖液，分裝至50 ml離心管，加入10 ml氯仿，7 000 r/min離心10 min，取上清，即為已擴增雞爪苓菌絲體cDNA文庫，保存備用。參照“1.2.5”滴定擴增的文庫(不加IPTG和X-Gal)。隨機選取23個噬菌斑，加入400 μl噬菌體稀釋緩沖液，4℃過夜。取1 μl模板進行PCR鑒定。PCR反應條件:94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min;30個循環。

1.2.7 EST分析。取5 μl雞爪苓菌絲體全長cDNA文庫，轉入質粒pTriplEx2載體。隨機選取20個單個菌落，采用菌落PCR檢測轉入成功率。根據PCR結果，選擇6個片段較長的cDNA進行EST分析。

2 結果與分析

2.1 雞爪苓菌絲體總RNA的提取 參照Trizol reagent試劑盒說明書，提取雞爪苓菌絲體總RNA(圖1)。結果顯示，菌絲體培養時間不同，總RNA的產率不同。7、14 d雞爪苓菌絲體總 RNA 的產量較高，分別為144.156、220.104 μg，28S與18S條帶清晰，比例約為1.5∶1.0。雞爪苓菌絲體培養21和28 d 產量較低，分別為71.638、3.580 μg，28S 與 18S 條帶清晰，比例約為 1.5∶1.0。

2.2 雞爪苓菌絲體的cDNA合成 用MMLV Reverse Transcriptase將雞爪苓菌絲體總RNA反轉錄合成cDNA第一鏈，通過LD-PCR合成雙鏈cDNA。電泳檢測，cDNA彌散于500～2 500 bp(圖2)，符合cDNA文庫建庫標準。

圖1 Trizol法提取不同時間段雞爪苓菌絲體總RNA

表1 不同時間段雞爪苓菌絲體總RNA的提取

圖2 LD-PCR合成產物雙鏈cDNA

圖3 雞爪苓菌絲體cDNA的分級分離

2.3 cDNA片段的分級分離 雞爪苓菌絲體cDNA經SfiI酶切后，用CHROMA SPIN-400柱進行分級分離，結果顯示在第7管開始出現cDNA(圖3)，收集第7～10個離心管內cDNA，純化濃縮。

2.4 文庫的滴度與插入片段的PCR檢測 原始文庫的滴度為1.66×106pfu/ml，藍白斑篩選重組率為96.97%，擴增文庫的滴度為3.88×109pfu/ml，達到文庫構建標準。隨機選取23個噬菌斑的PCR檢測，PCR產物主要位于500～1 000 bp(圖4)，符合EST測序的需要。

圖4 cDNA文庫插入片段的PCR產物

2.5 EST序列的分析 挑選5個單克隆，命名為cbsjzl1－5，(GenBank accession number:KM406240-KM406244)，進行測序。5個單克隆均含有ORF和UTR，其中4個ESTs存在高相似度的序列，并有相對應的蛋白質超家族，參與跨膜轉運、信號轉導、細胞的發育及分化等功能。

3 結論與討論

cDNA文庫是生物體某一時刻表達基因的集合，是獲取新基因的重要手段，已廣泛應用于不同生長階段基因表達變化的研究、某特定發育期基因表達情況及獲取組織特異性基因等方面［14－15］。影響cDNA文庫質量的因素較多，mRNA的完整性、cDNA小片段及合適的載體都會對cDNA文庫的代表性造成影響。該試驗中，采取Trizol法可高效快速提取雞爪苓菌絲體總RNA，降低mRNA的降解。通過CHROMA SPIN－400層析柱將cDNA分級分離，并選擇合適的cDNA片段。選擇λTripIEx作為載體，可提高某些低豐度基因的篩選率［16］。該試驗成功構建了雞爪苓菌絲體全長cDNA文庫，可進行大規模的EST序列分析，為研究長白山區雞爪苓的遺傳特異性、探索雞爪苓生長分化的分子機制提供理論基礎。

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