五色梅總黃酮含量測(cè)定與自由基清除活性分析

張偉+吳靜姝+宋照風(fēng)+李藝英+潘嘉慧+朱峰

摘要：以70%乙醇為溶劑，運(yùn)用超聲輔助和加熱回流法提取了五色梅（Lantana camara L.）根、莖、葉、果和花中的總黃酮。采用分光光度法測(cè)定了五色梅根、莖、葉、果和花中總黃酮含量。結(jié)果表明，五色梅花的總黃酮含量最高，為6.16%，其次是葉，含量為3.54%，根、莖和果的總黃酮含量依次為0.18%、1.76%和1.17%。五色梅葉的乙醇粗提物具有有效的羥基自由基清除活性。

關(guān)鍵詞：五色梅（Lantana camara L.）;黃酮;含量測(cè)定;分光光度法;自由基清除活性

中圖分類號(hào)：Q949.95;S58 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）21-5227-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.046

Determining the Content of Total Flavonoids in the Lantana camara L.

and Scavenging Activity of Free Radical

ZHANG Wei1，WU Jing-shu2，SONG Zhao-feng2，LI Yi-ying3，PAN Jia-hui4， ZHU Feng2

（1. Conghua College of Guangzhou Medical University， Conghua 510925， Guangdong， China; 2. Department of Chemistry and Chemical Engineering， Foshan University， Foshan 528231， Guangdong， China; 3. CAS-FS Biotech and Pharmaceutical Center， Foshan 528231， Guangdong， China; 4. Foshan Supervision Testing Center of Quality and Metrology， Foshan 528200， Guangdong， China）

Abstract： Using 70% ethanol as extraction solvent， the total flavonoids in the root， stem， leaf， fruit and flower of the plant Lantana camara L. were extracted by ultrasonic heating reflux， and determined by spectrophotometry. The results showed that the highest content of the total flavonoids was 6.16% in the flower， followed by 3.54% in the leaves. The content of the total flavonoids in the root， stem， and fruit was 0.18%， 1.76%， and 1.17%. Ethanol extracts from Lantana camara L. leaf had the effective scavenging activity of hydroxyl radical.

Key words： Lantana camara L.;flavonoid;content determination;spectrophotometry;free radical scavenging activity

藥用植物中的黃酮類化合物由于具有多種生物活性而備受關(guān)注。如槐花米中的蘆丁[1]和血橙皮[2]中的橙皮甙具有維生素P樣作用，能維持血管正常滲透壓，減低血管的脆性。葛根中的葛根黃酮[3]和銀杏中的銀杏黃酮[4]，具有擴(kuò)張冠狀血管作用。

五色梅（Lantana camara L.）為馬鞭草科馬纓丹屬一年生或多年生半藤本狀灌木，具有清熱解毒、散解止痛、祛風(fēng)止癢的功效，能治感冒高熱、痢疾、肺結(jié)核等病癥[5]。莖葉煎湯洗治濕疹、皮炎，搗爛敷患處能治跌打筋傷。有關(guān)生物活性研究表明，該植物粗提物表現(xiàn)出驅(qū)蟲殺蟲活性[6，7]、抗菌抗病毒活性[8-11]等。該植物精油[12，13]具有抗菌和細(xì)胞毒活性，但其化學(xué)組成隨著植物樣品采集時(shí)間和地點(diǎn)不同而不同。另外，國(guó)內(nèi)外研究者還系統(tǒng)研究了該植物的化學(xué)成分[14，15]，不僅發(fā)現(xiàn)了許多新的萜類和萘醌類等化合物，也發(fā)現(xiàn)了新的黃酮類化學(xué)成分，比如Camaraside[16]、Linaroside[17]、Lantanoside[17]、Camaroside[18]和3-methyl quercertin[19]。本試驗(yàn)首次通過(guò)分光光度法測(cè)定了五色梅根、莖、葉、果和花中總黃酮的含量，并評(píng)價(jià)了其清除羥基自由基的活性。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料、試劑和儀器

五色梅根、莖、葉、果和花樣品于2013年12月采集于佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院北院校區(qū)，根據(jù)文獻(xiàn)[5]鑒定為五色梅。新鮮五色梅根、莖、葉、果和花用去離子水洗凈、風(fēng)干、粉碎，備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（精確稱取15 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑，用70%乙醇溶解并定容至100 mL）。95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸均為分析純。

UV-2501PC型紫外-可見吸收光譜儀（日本島津公司）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?總黃酮的提取 ?準(zhǔn)確稱取5 g五色梅根干燥粉末，加入100 mL 70%乙醇，在溫度為50 ℃和功率為90 Hz條件下超聲提取3次，每次4 h。70%乙醇提取液過(guò)濾合并，濾渣再加100 mL 70%乙醇加熱回流提取1次，提取時(shí)間2 h。超聲提取和加熱回流提取的乙醇溶液合并，于50 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約50 mL。濃縮提取液轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶，用70%乙醇定容，得到五色梅根總黃酮待測(cè)液。五色梅莖、葉、果和花的總黃酮提取按同法操作。

1.2.2 ?總黃酮定性分析

1）熒光試驗(yàn)。分別取1 mL五色梅根、莖、葉、果和花待測(cè)液，在沸水浴上蒸干，加入硼酸的飽和丙酮溶液以及10%枸櫞酸丙酮溶液各1 mL，繼續(xù)蒸干。將殘?jiān)谧贤鉄粝抡丈洌^察熒光現(xiàn)象。

2）氨顯色反應(yīng)。將五色梅根、莖、葉、果和花待測(cè)液各滴于濾紙上，風(fēng)干后用氨氣熏蒸，觀察顏色變化。

1.2.3 ?總黃酮含量測(cè)定 ?精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 mL置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇至10 mL，搖勻，加50 g/L亞硝酸鈉溶液0.7 mL，搖勻后放置6 min，再加100 g/L硝酸鋁溶液0.7 mL，搖勻后放置6 min，再加入40 g/L氫氧化鈉溶液5 mL，用70%乙醇定容至25 mL，搖勻后放置10 min。以70%乙醇為空白對(duì)照，在420～600 nm內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，測(cè)定其最大吸收波長(zhǎng)。

線性回歸方程的建立：分別精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0～10 mL于25 mL容量瓶中，梯度1 mL，加入70%乙醇至10 mL，然后按測(cè)定波長(zhǎng)的方法操作，在505 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定其吸光度。

精確移取“1.2.1”五色梅根待測(cè)液1.5 mL置于25 mL容量瓶中，加70%乙醇至10 mL，然后按測(cè)定波長(zhǎng)的方法操作，在505 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值，3次平行，取平均值帶入線性回歸方程，計(jì)算總黃酮含量。五色梅莖、葉、果和花待測(cè)液總黃酮含量按相同方法測(cè)定。

采用加樣法進(jìn)行回收率的測(cè)定。分別精確移取“1.2.1”五色梅根、莖、葉、果和花待測(cè)液各1、2、3 mL置于25 mL容量瓶中，加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1 mL，再按樣品總黃酮含量測(cè)定方法測(cè)定其吸光度值，計(jì)算回收率。

1.2.4 ?羥基自由基清除活性 ?移取2 mmol/L硫酸亞鐵1 mL于10 mL刻度試管中，加入6 mmol/L雙氧水1 mL，搖勻后加入6 mmol/L水楊酸1 mL，搖勻，置于37 ℃水浴恒溫15 min，立即測(cè)定其吸光度值，記為A0。然后精確移取“1.2.1”五色梅根待測(cè)液1～7 mL加入試管，加水至10 mL，搖勻，靜置10 min，立即測(cè)其吸光度值，記為Ax。計(jì)算羥基自由基清除率。

羥基自由基清除率=[（A0-Ax）÷A0]×100%

五色梅莖、葉、果和花待測(cè)液清除羥基自由基的活性按相同的方法操作。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?黃酮定性分析

2.1.1 ?熒光試驗(yàn) ?五色梅根、莖、葉、果和花提取液反應(yīng)殘?jiān)谧贤鉄粝抡丈渚^察到強(qiáng)烈的熒光現(xiàn)象，表明提取液含有黃酮或黃酮甙。這是黃酮類化合物的典型反應(yīng)。

2.1.2 ?氨顯色反應(yīng) ?五色梅根、莖、葉、果和花提取液滴于濾紙上風(fēng)干后經(jīng)氨氣熏蒸后，立刻呈現(xiàn)亮黃色，紫外燈下照射觀察更為明顯。氨氣熏蒸后放置一段時(shí)間，顏色因氨氣揮發(fā)而褪色。這是黃酮類化合物的典型特征。熒光試驗(yàn)和氨顯色反應(yīng)結(jié)果均表明五色梅根、莖、葉、果和花的提取液中含有黃酮或其甙類。

2.2 ?總黃酮含量測(cè)定

通過(guò)波長(zhǎng)掃描，獲得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長(zhǎng)為505 nm，故確定505 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。以蘆丁濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)最小二乘法進(jìn)行線性擬合，得到線性回歸方程為A=0.010 54 C+0.024 23，R2=0. 992 21。

將五色梅根、莖、葉、果和花待測(cè)液在505 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光度（A）代入線性回歸方程，計(jì)算待測(cè)液中總黃酮含量并換算成每克生藥干粉樣品中的總黃酮含量，結(jié)果見表1。表1結(jié)果表明，五色梅花的總黃酮含量最高，達(dá)6.16%，其次是葉，含量為3.54%，然后是莖和果，含量分別為1.76%和1.17%，根中的總黃酮含量最少，為0.18%。

2.3 ?羥基自由基清除活性試驗(yàn)

參照Fenton反應(yīng)的方法建立反應(yīng)體系模型，利用雙氧水與二價(jià)鐵離子混合后產(chǎn)生的羥基自由基，但羥基自由基反應(yīng)活性強(qiáng)，存活時(shí)間短，若在反應(yīng)體系中加入水楊酸，能有效地捕捉羥基自由基并生成有色物質(zhì)。該物質(zhì)在波長(zhǎng)510 nm處有強(qiáng)吸收，若加入具有清除羥基自由基活性的樣品，則會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)羥基自由基，從而減少有色物質(zhì)的生成量。采用固定時(shí)間法，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定樣品反應(yīng)液的吸光度，并與未加入樣品的空白液的吸光度比較，根據(jù)公式計(jì)算出樣品對(duì)羥基自由基的清除率。試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，五色梅根、莖、葉、果和花的乙醇提取液均表現(xiàn)出一定程度的羥基自由基清除活性，而且隨著提取液體積的增加，活性也逐漸增強(qiáng)。其中五色梅葉的乙醇提取液活性最強(qiáng)，并且隨著提取液體積的增加，其活性更強(qiáng)。

3 ?小結(jié)與討論

以70%乙醇為溶劑，聯(lián)合運(yùn)用超聲輔助和加熱回流法提取了五色梅根、莖、葉、果和花樣品中的總黃酮。采用分光光度法，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，在505 nm波長(zhǎng)下測(cè)定了五色梅樣品中的總黃酮含量，結(jié)果五色梅花的總黃酮含量最高，其次是葉，根的總黃酮含量最少。回收率試驗(yàn)結(jié)果表明該方法可靠。

采用分光光度法測(cè)定了五色梅70%乙醇提取液樣品對(duì)羥基自由基的清除活性，結(jié)果顯示五色梅根、莖、葉、果和花樣品乙醇提取液均具有一定程度的羥基自由基清除活性，且其活性均隨著提取液加入量的增加而變強(qiáng)，其中葉提取液的清除作用最強(qiáng)，其次是花，然后依次是莖、果和根。

分析樣品總黃酮含量和清除自由基活性效果后發(fā)現(xiàn)，羥基自由基清除率與樣品中總黃酮含量不呈正比關(guān)系，原因是提取液樣品中除了含有具有羥基自由基清除作用的黃酮類化合物之外，還含有具有同樣作用的其他類型化合物，而這些物質(zhì)在五色梅不同部位中的含量與總黃酮含量不一致。根據(jù)研究結(jié)果[20]分析，可能是因?yàn)槲迳啡~中高含量的五環(huán)三萜類化合物L(fēng)antadenes導(dǎo)致葉提取液具有更強(qiáng)的羥基自由基清除活性。

綜上所述，五色梅不同部位均含有一定量的總黃酮，特別是其葉的乙醇提取物表現(xiàn)出較高的羥基自由基清除活性，因而藥用植物五色梅值得進(jìn)一步研究和開發(fā)。

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（責(zé)任編輯 ?趙 ?娟）

采用分光光度法測(cè)定了五色梅70%乙醇提取液樣品對(duì)羥基自由基的清除活性，結(jié)果顯示五色梅根、莖、葉、果和花樣品乙醇提取液均具有一定程度的羥基自由基清除活性，且其活性均隨著提取液加入量的增加而變強(qiáng)，其中葉提取液的清除作用最強(qiáng)，其次是花，然后依次是莖、果和根。

分析樣品總黃酮含量和清除自由基活性效果后發(fā)現(xiàn)，羥基自由基清除率與樣品中總黃酮含量不呈正比關(guān)系，原因是提取液樣品中除了含有具有羥基自由基清除作用的黃酮類化合物之外，還含有具有同樣作用的其他類型化合物，而這些物質(zhì)在五色梅不同部位中的含量與總黃酮含量不一致。根據(jù)研究結(jié)果[20]分析，可能是因?yàn)槲迳啡~中高含量的五環(huán)三萜類化合物L(fēng)antadenes導(dǎo)致葉提取液具有更強(qiáng)的羥基自由基清除活性。

綜上所述，五色梅不同部位均含有一定量的總黃酮，特別是其葉的乙醇提取物表現(xiàn)出較高的羥基自由基清除活性，因而藥用植物五色梅值得進(jìn)一步研究和開發(fā)。

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（責(zé)任編輯 ?趙 ?娟）

采用分光光度法測(cè)定了五色梅70%乙醇提取液樣品對(duì)羥基自由基的清除活性，結(jié)果顯示五色梅根、莖、葉、果和花樣品乙醇提取液均具有一定程度的羥基自由基清除活性，且其活性均隨著提取液加入量的增加而變強(qiáng)，其中葉提取液的清除作用最強(qiáng)，其次是花，然后依次是莖、果和根。

分析樣品總黃酮含量和清除自由基活性效果后發(fā)現(xiàn)，羥基自由基清除率與樣品中總黃酮含量不呈正比關(guān)系，原因是提取液樣品中除了含有具有羥基自由基清除作用的黃酮類化合物之外，還含有具有同樣作用的其他類型化合物，而這些物質(zhì)在五色梅不同部位中的含量與總黃酮含量不一致。根據(jù)研究結(jié)果[20]分析，可能是因?yàn)槲迳啡~中高含量的五環(huán)三萜類化合物L(fēng)antadenes導(dǎo)致葉提取液具有更強(qiáng)的羥基自由基清除活性。

綜上所述，五色梅不同部位均含有一定量的總黃酮，特別是其葉的乙醇提取物表現(xiàn)出較高的羥基自由基清除活性，因而藥用植物五色梅值得進(jìn)一步研究和開發(fā)。

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（責(zé)任編輯 ?趙 ?娟）