毛冬青總皂苷對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究

李洪亮+賀方興+程齊來

摘要：為研究毛冬青（Ilex pubescens Hook et Arn.）總皂苷對腦缺血再灌注損傷的保護作用，并初步探討其保護作用機制，將試驗大鼠隨機分為假手術組、模型對照組、毛冬青總皂苷高、中、低劑量組及陽性藥物對照組，運用大鼠大腦中動脈栓塞，制作腦缺血再灌注損傷模型，缺血10 min后，毛冬青總皂苷給藥組及陽性藥物組分別于舌下靜脈給予高、中、低劑量的毛冬青總皂苷及陽性藥物（香丹注射液），假手術組、模型組給予等體積的生理鹽水。缺血60 min后再灌注，24 h后，每組取8只大鼠斷頭取腦，TTC染色，測定腦梗死體積;取血離心后，取血清，比色法測血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性及丙二醛（MDA）的含量;每組取2只大鼠運用病理組織形態學檢驗，觀察毛冬青總皂苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織細胞損傷的影響。結果表明，毛冬青總皂苷不同劑量組與模型對照組相比，其腦梗死面積減小，病理變化較輕;血清SOD的活性顯著升高;毛冬青總皂苷高劑量組與模型對照組相比較，其MDA含量顯著降低。說明毛冬青總皂苷對腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，其保護機制與毛冬青總皂苷抗氧化作用及增強氧自由基的清除有關。

關鍵詞：毛冬青（Ilex pubescens Hook et Arn.）總皂苷;腦缺血再灌注損傷;保護作用

中圖分類號：R285.5 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）21-5200-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.039

Protective Effects of Total Saponins from Ilex pubescens on Ischemia

Reperfusion Injury of Rats and Its Mechanism

LI Hong-lianga，HE Fang-xingb，CHENG Qi-laia

（a.College of Pharmacy;b. Bascial medical college， Gannan medical College， Ganzhou 341000， Jiangxi， China）

Abstract： To study the protective effect of total saponins from Ilex pubescens Hook et Arn on cerebral ischemia reperfusion injury and the potentially mechanism， the rats were randomly divided into sham operation group， model group， saponins of total saponins from Ilex pubescens Hook （high， middle， low） dose group and positive medicine control group. Same volume solvent or total saponins from Mao Dongqing was given in high， middle and low dosage， or positive medicine such as was given Xiangdan was injected sublingually 10min later of operation. The rats cerebral ischemia reperfusion model was made by middle cerebral artery embolization. ?After ischemia for 60 mins and reperfusion for 24 hours， 8 rats were taken from every group and removed brain by decapitation， then dyed by TTC and measured the volume of cerebral infarction， the activity of SOD， the content of GSH-Px and MDA in serum by colorimetry. 2 rats were taken from each group for histopathological examination. The effects of total saponins of Mao Dongqing on brain tissue injury caused by cerebral ischemia reperfusion injury were observed. The results showed that the volumes of cerebral infarction in Mao Dongqin treatment group reduced. Pathological changes were much less. The activity of SOD increased compared with model control group. The content of MDA decreased in the treatment group of high dosage. It is indicated that the total saponins from Mao Dongqing had certain protective effect on cerebral ischemia reperfusion. The mechanism might be related with anti-oxygenation and scavenging strengthen on oxygen free radicals.

Key words：total saponins from Ilex pubescens Hook et Arn （Mao Dongqing）;cerebral ischemia reperfusion injury;Protective effect

毛冬青（Ilex pubescens Hook et Arn.）系冬青科（Aquifoliaceae）冬青屬多年生常綠灌木，盛產于廣東、廣西、福建、湖南、江西等地。毛冬青具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒功效，臨床上常用于冠心病、心絞痛和脈管炎等的治療。冬青屬全世界有400余種，中國約150種[1]。毛冬青的主要化學成分為毛冬青總皂苷和黃酮苷，毛冬青根主要成分為三萜皂苷類，主要有毛冬青皂苷甲、毛冬青皂苷B1、毛冬青皂苷B、毛冬青酸以及救必應酸等[2]。大量研究表明，毛冬青總皂苷對心血管系統具有良好的保護作用，其能夠通過直接和間接作用發揮對心腦血管的保護作用，降低心腦血管疾病的發病率。贛南醫學院腦血管重點實驗室最近研究表明，毛冬青總皂苷具有良好的抗多因素誘發實驗性心律失常療效，其中對心肌缺血再灌注損傷誘發實驗性心律失常療效十分顯著。本試驗研究了毛冬青總皂苷對腦缺血再灌注損傷的保護作用，并初步探討了其保護機制，為毛冬青總皂苷的進一步開發利用提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?試劑及藥物

毛冬青總皂苷由贛南醫學院腦血管重點實驗室提供，純度92%，用注射用水配成所需的濃度;超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析純。

1.2 ?試驗動物

雄性SD大鼠60只，體重（260+20） g，由江西中醫學院實驗動物中心提供，合格證號：JZDWNo：2012-0182，許可證號：SCXK（贛）2010-0001。

1.3 ?方法

1.3.1 ?試驗動物分組與大鼠腦缺血再灌注損傷模型的制備[3] ? 雄性SD大鼠60只隨機均分成6組，即假手術組、腦缺血再灌注損傷模型對照組、毛冬青總皂苷高劑量（20 mg/kg）組、毛冬青總皂苷中劑量（10 mg/kg）組、毛冬青總皂苷低劑量（5 mg/kg）組、陽性藥物（香丹注射液）對照組。大鼠用10%水合氯醛溶液（350 mg/kg）麻醉，參照Longa等[3]的方法制備大腦中動脈阻斷模型，將一尼龍線（長4 cm，直徑0.2 mm）經頸總動脈主干切口緩慢向頸內動脈入顱方向推進，以頸總動脈分叉處為標記，推進18～20 mm感到輕微阻力時，即達到較細大腦前動脈，阻斷大腦中動脈的所有血液供應，60 min后，拔出尼龍線并扎緊動脈殘端，縫合皮下組織和皮膚，完成腦缺血再灌注損傷模型。假手術組大鼠只暴露和分離出頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，不閉塞大腦中動脈。術中嚴格控制室溫在23～25 ℃。手術結束后藥物治療組分別從舌下靜脈注射不同劑量的毛冬青總皂苷及陽性藥物（香丹注射液），假手術組和模型組給予同體積的生理鹽水。

1.3.2 ?神經功能缺損評分 ?采用Zea Longa評分方法，各組SD大鼠按“1.3.1”的方法處理后，使動脈血恢復血流供應后再灌注不同藥物，24 h后，采用單盲法進行評分，評分標準如下：0分：無神經系統功能缺失癥狀，活動正常者;1分：不能完全伸展對側前肢者;2分：出現左側Homer征，爬行時出現向右轉圈者;3分：行走時身體向右側偏癱傾倒者;4分：不能自行行走者，意識喪失者。

1.3.3 ?毛冬青總皂苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死范圍的影響 ?各組SD大鼠按“1.3.1”的方法處理后，使動脈血恢復血流供應后再灌注不同藥物，24 h后，用上述方法麻醉，斷頭處死大鼠。取腦，將前腦沿冠狀面切成厚度基本相同的5片，腦片置于5 mL 2%TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑，Triphenyl tetrazoliu chloride，TTC）染色溶液中，37 ℃避光孵育30 min。經染色后非缺血區呈玫瑰紅色，腦梗死區呈灰白色，按下列公式計算梗死率。梗死率=梗死區面積/總面積×100%。

1.3.4 ?血清生化指標測定 ?各組SD大鼠按“1.3.1”的方法處理后，使動脈血恢復血流供應后再灌注不同藥物，24 h后，所有大鼠麻醉后斷頭取血，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取血清，-80 ℃保存。嚴格按試劑盒操作測定血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

1.4 ?統計分析

數據均以SPSS14.0進行統計分析，神經學評分進行秩和檢驗，腦梗死面積比進行t檢驗，血清SOD、GSH-Px活性、MDA含量均進行單因素方差分析，結果以平均值±標準差表示。

2 ?結果與分析

2.1 ?大鼠腦缺血再灌注損傷神經學評分

圖1結果顯示，與模型對照組比較，毛冬青總皂苷中、高劑量組大鼠的神經功能缺損評分均顯著（P<0.05或P<0.01）降低，說明毛冬青總皂苷可有效改善腦缺血對大鼠神經功能的損傷狀況。毛冬青總皂苷不同劑量組大鼠神經功能評分與陽性藥物對照組相比較差異均不顯著（P>0.05）。說明毛冬青總皂苷與香丹注射液相比，其改善腦缺血對大鼠神經功能損傷的療效并沒有明顯差異。

2.2 ?毛冬青總皂苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死范圍的影響

圖2、圖3結果顯示，與模型對照組比較，毛冬青總皂苷中、高劑量組大鼠的腦梗死率均顯著（P<0.05或P<0.01）降低，說明毛冬青總皂苷可有效改善腦缺血引起的局灶性腦梗死。

2.3 ?毛冬青總皂苷對腦缺血再灌注損傷大鼠血清中SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

表1結果顯示，與假手術組相比較，毛冬青總皂苷不同劑量組、陽性藥物對照組及模型對照組大鼠血清SOD、GSH-Px活性均顯著（P<0.05或P<0.01）降低，說明腦缺血再灌注損傷模型建立成功，該方法可引起動物血清SOD、GSH-Px活性降低。與模型對照組相比較，毛冬青總皂苷不同劑量組及陽性藥物對照組大鼠血清SOD活性顯著（P<0.05）增加，說明毛冬青總皂苷和香丹注射液能提高腦缺血再灌注損傷后大鼠血清SOD活性。與模型對照組相比較，毛冬青總皂苷高劑量組可顯著降低大鼠血清MDA含量（P<0.05），其他劑量組與模型對照組相比則無明顯差異。

2.4 ?毛冬青總皂苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織細胞損傷的影響

由圖4可知，腦缺血再灌注損傷模型組切片神經原、膠質細胞的細胞間隙增寬，神經纖維網呈空泡樣變;神經原胞漿及胞膜形態不規則，邊界不清，胞核濃縮，部分細胞呈固縮狀（圖4E）。假手術組神經原、膠質細胞形態正常，結構完整，無間質水腫;神經原胞漿豐富、均勻，胞核呈圓形或橢圓形，核仁清晰（圖4F）。毛冬青總皂苷低劑量組出現小血管周圍間隙增寬，炎性細胞浸潤（圖4A）。毛冬青總皂苷中、高劑量組和陽性藥物對照組神經原、膠質細胞形態相對正常，結構相對完整，病理變化輕（圖4B、圖4C、圖4D）。

3 ?討論

近年來，國內外對毛冬青、毛冬青有效成分及相關衍生物（如毛冬青甲素）的藥理及臨床研究主要集中在心腦血管及抗炎作用等方面[4]。毛冬青酸具有抑制動、靜脈血栓形成的作用[5]。毛冬青甲素管內給藥對花生四烯酸（AA）誘導兔血小板聚集和MDA生成的影響試驗結果表明，毛冬青甲素在抑制AA誘導血小板聚集的同時，對AA誘導血小板生成MDA也有抑制作用，且兩種抑制作用有相關性，表明毛冬青甲素抗血小板作用可能與其抑制過氧化脂質有關[6]。毛冬青甲素體外給藥試驗能抑制ADP、膠原誘導的人、兔血小板和5-羥色胺釋放，劑量與效應相關，給大鼠體內給藥，也能明顯抑制血小板聚集。毛冬青甲素治療缺血性腦血管病取得了較好的療效[7，8]。贛南醫學院腦血管重點實驗室研究證明毛冬青總皂苷能降低機體氧化應激反應，本試驗結果中毛冬青總皂苷可明顯增加腦缺血再灌注損傷大鼠血清中SOD的活性，毛冬青總皂苷高劑量組MDA的含量明顯降低，這也證明了毛冬青總皂苷具有良好的抗氧化作用。腦梗死范圍的大小，常用來衡量腦缺血再灌注損傷的程度。本試驗結果表明，不同劑量的毛冬青總皂苷均能減小模型大鼠腦梗死范圍，說明毛冬青總皂苷對腦缺血再灌注損傷導致的腦梗死有一定的抑制作用。

炎性細胞因子在腦缺血再灌注損傷中起著重要作用，炎性細胞因子的過度表達加重腦缺血缺氧損傷。炎性細胞因子在缺血組織的聚集是加重腦缺血缺氧的重要因素。它們調節細胞表面黏附分子的數量和功能，造成白細胞與內皮細胞的黏附，阻斷微循環，影響缺血半暗帶區血供，并使血漿成分聚集于管壁，導致管壁增厚、狹窄和腦梗死[9]。從病理組織形態學檢驗結果可以看出，毛冬青總皂苷低劑量組大鼠出現小血管周圍間隙增寬，炎性細胞浸潤，毛冬青總皂苷中劑量組、高劑量組和陽性藥物對照組大鼠神經原、膠質細胞形態相對正常，結構相對完整，病理變化輕，這說明毛冬青總皂苷能夠抑制炎性細胞的產生從而減輕腦缺血再灌注導致的腦組織損傷。因此毛冬青總皂苷對大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，但毛冬青總皂苷的具體作用機制還有待于進一步的研究。

參考文獻：

[1] 熊友香，李 ?昶，羅憲堂.毛冬青的化學成分、藥理作用研究進展[J].中藥材，2002，25（5）：371.

[2] 秦國偉，陳政雄，徐任生，等.毛冬青化學成分的研究Ⅱ.毛冬青皂苷甲的化學結構[J].化學學報，1987（3）：249.

[3] LONGA E Z， WEINSTEIN P R， CARLSONS S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke， 1989， 20（1）：84-91.

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[5] 張芳林，郭 ?晟，朱令元.毛冬青酸抗血栓實驗研究及機制探討[J].江西醫學院學報，2003，43（2）：33.

[6] 楊 ?濤，陳桂君，李伍善.毛冬青甲素體外給藥對花生四烯酸誘導的兔血小板聚集和丙二醛生成的影響[J].首都醫學院學報，1992，13（3）：171.

[7] 汪 ?鐘，杜金香，朱國強.毛冬青甲素對血小板功能和形態的影響[J].中西結合雜志，1985，5（4）：232.

[8] 王志文，陳景華.毛冬青根為主治療血栓閉塞性脈管炎18例[J].山東中醫雜志，1994，13（12）：541.

[9] 張 ?玲，余紹祖，吳國祥.大鼠腦缺血再灌注后TNF-α、IL-β及細胞間粘附分子-1mRNA的表達[J].卒中與神經疾病，2001（2）：77-79.

2.3 ?毛冬青總皂苷對腦缺血再灌注損傷大鼠血清中SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

表1結果顯示，與假手術組相比較，毛冬青總皂苷不同劑量組、陽性藥物對照組及模型對照組大鼠血清SOD、GSH-Px活性均顯著（P<0.05或P<0.01）降低，說明腦缺血再灌注損傷模型建立成功，該方法可引起動物血清SOD、GSH-Px活性降低。與模型對照組相比較，毛冬青總皂苷不同劑量組及陽性藥物對照組大鼠血清SOD活性顯著（P<0.05）增加，說明毛冬青總皂苷和香丹注射液能提高腦缺血再灌注損傷后大鼠血清SOD活性。與模型對照組相比較，毛冬青總皂苷高劑量組可顯著降低大鼠血清MDA含量（P<0.05），其他劑量組與模型對照組相比則無明顯差異。

2.4 ?毛冬青總皂苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織細胞損傷的影響

由圖4可知，腦缺血再灌注損傷模型組切片神經原、膠質細胞的細胞間隙增寬，神經纖維網呈空泡樣變;神經原胞漿及胞膜形態不規則，邊界不清，胞核濃縮，部分細胞呈固縮狀（圖4E）。假手術組神經原、膠質細胞形態正常，結構完整，無間質水腫;神經原胞漿豐富、均勻，胞核呈圓形或橢圓形，核仁清晰（圖4F）。毛冬青總皂苷低劑量組出現小血管周圍間隙增寬，炎性細胞浸潤（圖4A）。毛冬青總皂苷中、高劑量組和陽性藥物對照組神經原、膠質細胞形態相對正常，結構相對完整，病理變化輕（圖4B、圖4C、圖4D）。

3 ?討論

近年來，國內外對毛冬青、毛冬青有效成分及相關衍生物（如毛冬青甲素）的藥理及臨床研究主要集中在心腦血管及抗炎作用等方面[4]。毛冬青酸具有抑制動、靜脈血栓形成的作用[5]。毛冬青甲素管內給藥對花生四烯酸（AA）誘導兔血小板聚集和MDA生成的影響試驗結果表明，毛冬青甲素在抑制AA誘導血小板聚集的同時，對AA誘導血小板生成MDA也有抑制作用，且兩種抑制作用有相關性，表明毛冬青甲素抗血小板作用可能與其抑制過氧化脂質有關[6]。毛冬青甲素體外給藥試驗能抑制ADP、膠原誘導的人、兔血小板和5-羥色胺釋放，劑量與效應相關，給大鼠體內給藥，也能明顯抑制血小板聚集。毛冬青甲素治療缺血性腦血管病取得了較好的療效[7，8]。贛南醫學院腦血管重點實驗室研究證明毛冬青總皂苷能降低機體氧化應激反應，本試驗結果中毛冬青總皂苷可明顯增加腦缺血再灌注損傷大鼠血清中SOD的活性，毛冬青總皂苷高劑量組MDA的含量明顯降低，這也證明了毛冬青總皂苷具有良好的抗氧化作用。腦梗死范圍的大小，常用來衡量腦缺血再灌注損傷的程度。本試驗結果表明，不同劑量的毛冬青總皂苷均能減小模型大鼠腦梗死范圍，說明毛冬青總皂苷對腦缺血再灌注損傷導致的腦梗死有一定的抑制作用。

炎性細胞因子在腦缺血再灌注損傷中起著重要作用，炎性細胞因子的過度表達加重腦缺血缺氧損傷。炎性細胞因子在缺血組織的聚集是加重腦缺血缺氧的重要因素。它們調節細胞表面黏附分子的數量和功能，造成白細胞與內皮細胞的黏附，阻斷微循環，影響缺血半暗帶區血供，并使血漿成分聚集于管壁，導致管壁增厚、狹窄和腦梗死[9]。從病理組織形態學檢驗結果可以看出，毛冬青總皂苷低劑量組大鼠出現小血管周圍間隙增寬，炎性細胞浸潤，毛冬青總皂苷中劑量組、高劑量組和陽性藥物對照組大鼠神經原、膠質細胞形態相對正常，結構相對完整，病理變化輕，這說明毛冬青總皂苷能夠抑制炎性細胞的產生從而減輕腦缺血再灌注導致的腦組織損傷。因此毛冬青總皂苷對大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，但毛冬青總皂苷的具體作用機制還有待于進一步的研究。

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2.3 ?毛冬青總皂苷對腦缺血再灌注損傷大鼠血清中SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

表1結果顯示，與假手術組相比較，毛冬青總皂苷不同劑量組、陽性藥物對照組及模型對照組大鼠血清SOD、GSH-Px活性均顯著（P<0.05或P<0.01）降低，說明腦缺血再灌注損傷模型建立成功，該方法可引起動物血清SOD、GSH-Px活性降低。與模型對照組相比較，毛冬青總皂苷不同劑量組及陽性藥物對照組大鼠血清SOD活性顯著（P<0.05）增加，說明毛冬青總皂苷和香丹注射液能提高腦缺血再灌注損傷后大鼠血清SOD活性。與模型對照組相比較，毛冬青總皂苷高劑量組可顯著降低大鼠血清MDA含量（P<0.05），其他劑量組與模型對照組相比則無明顯差異。

2.4 ?毛冬青總皂苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織細胞損傷的影響

由圖4可知，腦缺血再灌注損傷模型組切片神經原、膠質細胞的細胞間隙增寬，神經纖維網呈空泡樣變;神經原胞漿及胞膜形態不規則，邊界不清，胞核濃縮，部分細胞呈固縮狀（圖4E）。假手術組神經原、膠質細胞形態正常，結構完整，無間質水腫;神經原胞漿豐富、均勻，胞核呈圓形或橢圓形，核仁清晰（圖4F）。毛冬青總皂苷低劑量組出現小血管周圍間隙增寬，炎性細胞浸潤（圖4A）。毛冬青總皂苷中、高劑量組和陽性藥物對照組神經原、膠質細胞形態相對正常，結構相對完整，病理變化輕（圖4B、圖4C、圖4D）。

3 ?討論

近年來，國內外對毛冬青、毛冬青有效成分及相關衍生物（如毛冬青甲素）的藥理及臨床研究主要集中在心腦血管及抗炎作用等方面[4]。毛冬青酸具有抑制動、靜脈血栓形成的作用[5]。毛冬青甲素管內給藥對花生四烯酸（AA）誘導兔血小板聚集和MDA生成的影響試驗結果表明，毛冬青甲素在抑制AA誘導血小板聚集的同時，對AA誘導血小板生成MDA也有抑制作用，且兩種抑制作用有相關性，表明毛冬青甲素抗血小板作用可能與其抑制過氧化脂質有關[6]。毛冬青甲素體外給藥試驗能抑制ADP、膠原誘導的人、兔血小板和5-羥色胺釋放，劑量與效應相關，給大鼠體內給藥，也能明顯抑制血小板聚集。毛冬青甲素治療缺血性腦血管病取得了較好的療效[7，8]。贛南醫學院腦血管重點實驗室研究證明毛冬青總皂苷能降低機體氧化應激反應，本試驗結果中毛冬青總皂苷可明顯增加腦缺血再灌注損傷大鼠血清中SOD的活性，毛冬青總皂苷高劑量組MDA的含量明顯降低，這也證明了毛冬青總皂苷具有良好的抗氧化作用。腦梗死范圍的大小，常用來衡量腦缺血再灌注損傷的程度。本試驗結果表明，不同劑量的毛冬青總皂苷均能減小模型大鼠腦梗死范圍，說明毛冬青總皂苷對腦缺血再灌注損傷導致的腦梗死有一定的抑制作用。

炎性細胞因子在腦缺血再灌注損傷中起著重要作用，炎性細胞因子的過度表達加重腦缺血缺氧損傷。炎性細胞因子在缺血組織的聚集是加重腦缺血缺氧的重要因素。它們調節細胞表面黏附分子的數量和功能，造成白細胞與內皮細胞的黏附，阻斷微循環，影響缺血半暗帶區血供，并使血漿成分聚集于管壁，導致管壁增厚、狹窄和腦梗死[9]。從病理組織形態學檢驗結果可以看出，毛冬青總皂苷低劑量組大鼠出現小血管周圍間隙增寬，炎性細胞浸潤，毛冬青總皂苷中劑量組、高劑量組和陽性藥物對照組大鼠神經原、膠質細胞形態相對正常，結構相對完整，病理變化輕，這說明毛冬青總皂苷能夠抑制炎性細胞的產生從而減輕腦缺血再灌注導致的腦組織損傷。因此毛冬青總皂苷對大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，但毛冬青總皂苷的具體作用機制還有待于進一步的研究。

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