一株產黑色素鏈霉菌的分類鑒定

趙昌會+葉德贊

摘要：菌株S3是從廈門石胄頭近海海水中分離到的，不產生抗菌活性物質，而產黑色素的一株放線菌。在其形態、培養及生理生化特征、細胞壁組分測定等傳統的分類學方法的基礎上測定和分析了菌株的16S rDNA序列。結果表明，菌株S3在多種培養基上產黑色素，孢子橢圓或圓柱狀，在ISP培養基上培養特征與Streptomyces Puniciscabiei基本一致，菌株S3的16S rDNA序列與S. Puniciscabiei的同源性為99.595%，鑒定其為S. Puniciscabiei。

關鍵詞：鏈霉菌，黑色素，分類

中圖分類號：Q93 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）21-5145-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.023

Taxonomy of the Streptomyces Producing Melanin

ZHAO Chang-hui1，YE De-zan2，3

（1.Hunan University of Science and Engineering， Yongzhou 425100， Hunan， China;

2.The Third Institute of Oceanography， State Oceanic Administration， Xiamen 361005，Fuzhou， China;

3.The Key Laboratory of Marine Biogenetic Resources of State Oceanic Administration， Xiamen 361005，Fuzhou， China）

Abstract： The actinomycete strain S3 producing melanin with no antibacteria activity was isolated from water samples collected from Shizhoutou of Xiamen in China. Strain S3 was identified by methods of traditional and molecular biological taxonomy including determination of morphological and cultural characteristics， physiological and biochemical properties， cell wall components and 16S rDNA sequences analysis. Results showed that strain S3 produced melanin on many medium. Spores were oval or columned in ship. Cultural characteristics of strain S3 on ISP medium were in close agreement with S. Puniciscabiei. The 16S rDNA sequence of strain S3 had 99.595% similarity with that of S. Puniciscabiei. The strain S3 was identified as S. Puniciscabiei.

Key words： Streptomyces， melanin， taxonmy

黑色素（Melanin）廣泛存在于自然界生物體內，是一類由L-多巴、酪氨酸和半胱氨酸氧化或聚合而成的天然或合成色素[1]。它是醫藥、農業及化妝品行業的一種重要的生產原料。由于從動植物體內提取黑色素的生產過程繁瑣、成本高，合成色素一般對人體有害，而產黑色素的微生物資源豐富，且生產工藝簡單易行，產品無毒害，穩定性好。因此，研究微生物發酵產生黑色素具有很大的優勢[2-4]。產黑色素的微生物有細菌、真菌及放線菌等。目前對陸境產黑色素的微生物研究較多，而對海洋中的微生物的報道較少。本研究從廈門石胄頭海水中分離到一株放線菌，該菌具有產黑色素的能力，以期為開發產黑色素的海洋微生物打下基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?菌種來源 ?菌株S3，大腸桿菌（Escherichia coli），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus），宛氏擬青霉（Paecilomyces variotii），熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），白假絲酵母（Candida albicans），以上菌株均由國家海洋局第三海洋研究所生物重點實驗室保存。

1.1.2 ?主要試劑及儀器 ?質粒提取試劑盒購自上海生工;DNA marker、dNTPs、Taq酶等購自Takara公司;Biometre公司PCR擴增儀（T3）;Eppendorf公司微型臺式離心機;日本JEOL公司JEM-1230透射式電鏡;德國Bruker公司TENSOR 27型紅外光譜儀。

1.1.3 ?培養基 ?2216E細菌培養基;Tyr發酵培養基[5];酪素培養基[6]及國際鏈霉菌計劃（ISP）推薦的7種培養基[7];LB培養基;黃豆粉煮汁培養基：黃豆粉40 g，冷水調糊后加至1 L煮20 min，經紗布過濾，加入葡萄糖20 g，定容至1 L;孢子形成培養基[8];以上培養基均以人工海水與蒸餾水各半配置，1×105 Pa滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 ?樣品采集及菌種分離 ?從廈門石胄頭（退潮后的上浮水）、筼筜湖、白城、芙蓉湖、船塢（退潮后的沉積物）采集到5個樣品，分別取未稀釋的水樣及10倍稀釋的水樣和泥樣，涂布于2216E、Tyr及酪素平板上，于28 ℃培養5 d，挑取呈黑色的菌落，進行分離純化。從石胄頭海水中分離到菌株S3。

1.2.2 ?發酵培養及抑菌試驗 ?將菌株S3在Tyr發酵培養基活化3 d，分別接種于LB培養基和黃豆粉煮汁培養基，28 ℃，180 r/min搖床培養10 d。取發酵液分別接種涂布有待試菌平板的濾紙片上，28 ℃培養檢測抑菌活性。

1.2.3 ?孢子形態及培養特征觀察 ?將菌株S3接種于ISP、2216E和產孢等培養基，28 ℃培養觀察菌絲生長變化，利用電子顯微鏡觀察孢子鏈和孢子形態。

1.2.4 ?黑色素的提取及鑒定 ?將菌株S3接種于Tyr發酵培養基，發酵5 d，提取黑色素參考文獻[9，10]。取黑色素純品少量，用溴化鉀壓片法測紅外吸收光譜。

1.2.5 ?生理生化的測定 ?參照文獻[7，11，12]相關內容。

1.2.6 ?菌株的鑒定 ?菌體于液氮迅速冷凍15 s，其余步驟參考文獻[13]并加以改進。PCR擴增采用的引物為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′），反應條件：95 ℃ 5 min;94 ℃ 40 S，56 ℃ 40 S，72 ℃ 2 min，30循環;72 ℃ 10 min。PCR產物用經檢測割膠純化，連接到載體PMDt-vector，轉化到感受態細胞E.coli DH 5a中37 ℃培養檢測，挑取單菌落37 ℃液體培養過夜，利用試劑盒提取質粒，經酶切鑒定，送交上海美吉生物技術有限公司測序，測序引物為P300（5′-CCAGACTCCTACGGGAGGCAGC-3′），RP500（5′-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCA-3′），PKCT（5'-TGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTG-3'）。測序結果用EzTaxon Server version2.1數據庫對菌株的16S rDNA序列進行分析，然后用MEGA 4.0軟件采用鄰接法算法構建系統發育樹，并進行親緣性分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?菌株S3的形態及培養特征

菌株S3在LB、黃豆粉煮汁培養基中發酵10 d，發酵液除了對黑曲霉有較弱抑制作用外，對其余試驗菌株均無抑菌活性。在LB、2216E、Tyr、產孢等培養基上生長2～5 d，菌落呈白色，菌落較小，圓形，突起，光滑（培養一段時間后菌落較干燥），不易挑取，顯微鏡下菌體呈絲狀，菌落周圍產生可溶性黑色素，基內菌絲和氣生菌絲不發達。在產孢培養基上培養約15 d，有孢子產生，孢子呈白色，橢圓，表面光滑（圖1）。菌株S3在ISP培養基上培養5 d，生長狀況見表1。在ISP1、ISP3和ISP4上生長良好，氣生菌絲白灰色或淺黃色，基內菌絲呈淺黃色;在ISP2、ISP5、ISP6和ISP7上生長較弱，氣生菌絲呈白灰色或灰色，基內菌絲在ISP2和ISP5上呈黃色，在ISP6和ISP7上呈灰色，在ISP1、ISP4和ISP5上產生可溶性黃色素，而在ISP7上產生可溶性黑色素。

2.2 ?菌株S3的生理生化特征

挑取菌株S3的新鮮菌體于3% KOH中，無拉絲現象，革蘭氏陽性，H2S、VP及明膠液化試驗呈陰性，酶觸試驗呈陽性，銅離子（0.1 g/L）利于其產生黑色素。菌株S3不利用檸檬酸和木糖，對葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、纖維二糖及甘油利用較好，以蛋白胨或酵母膏為氮源時生長較好，在無機氮源上生長較慢（表2）。

2.3 ?黑色素的鑒定

紅外光譜分析表明，樣品在3 300～3 400 cm-1、

1 640 cm-1附近有強吸收峰， 在1 450～1 600 cm-1、2 349 cm-1、2 900 cm-1附近有弱吸收峰;1 236 cm-1附近有中強吸收峰（圖2），根據文獻報道3 300 cm-1處的吸收峰是-OH、-NH2的伸展振動引起，1 643 cm-1處吸收峰主要是C═C、-COO-、C═O伸展振動引起，圖2與文獻[14]的結果相似。不同來源的黑色素光譜圖有所差異，但特征峰所在位置相近，說明其主要功能團較為一致。

2.4 ?菌株S3的鑒定

菌株S3的16S rDNA序列為1 490 bp，Genebank登錄號為JN547724。將該序列與EzTaxon Server version2.1中相關序列進行同源性比對，選取同源性較高的21株鏈霉菌的16S rDNA序列構建系統發育樹，如圖3所示。菌株S3與S. Puniciscabiei（AF361785）和S.durhamensis（AY999785）處于進化樹的中的同一分支，同源性分別為99.595%和99.389%。S. Puniciscabiei能引起馬鈴薯的瘡痂病，在ISP2培養基上培養20 d，孢子顏色由白色變成紫色或紅色，菌株S3的孢子無此變化，在純培養過程中無吸水現象，生理生化特征與S. Puniciscabiei差別不大，所以將菌株S3應歸屬于S. Puniciscabiei。

3 ?小結與討論

在培養、生理生化及孢子特征的基礎上，結合16S rDNA序列分析，將菌株S3鑒定為S. puniciscabiei。2003年Park首次報道了S. Puniciscabiei以來，除了對該菌株的形態特征及分子生物學特征進行了研究外[15]，尚未見該菌株其他方面的報道。GenBank中，菌株S3的16S rDNA序列與韓國和美國學者分別提交的AF361785和AY999785的同源性為99.595%和99.389%。3種菌株都可產生黑色素，但他們產黑色素的培養基有所差異，如菌株S3可在LB、2216E、Tyr、產孢等培養基上產黑色素。

在培養特征和生理生化特征方面，除了對鼠李糖利用不同外，菌株S3與S. puniciscabiei完全一致。在LB及黃豆粉培養上不產生抗菌活性物質，不具有植物病害生物防治潛力，對其是否引起馬鈴薯瘡痂病有待進一步研究，菌株S3產生的黑色素與已知黑色素共性相符合，具有良好的開發潛力，對其產黑色素的發酵條件將做進一步研究。

致謝：本研究菌株的電鏡照片由國家海洋局第三海洋研究所谷力老師拍攝，16S rDNA的拼接由廈門大學生命科學學院羅晶晶完成，在此一并表示感謝！

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（責任編輯 ?張 ?毅）

在培養特征和生理生化特征方面，除了對鼠李糖利用不同外，菌株S3與S. puniciscabiei完全一致。在LB及黃豆粉培養上不產生抗菌活性物質，不具有植物病害生物防治潛力，對其是否引起馬鈴薯瘡痂病有待進一步研究，菌株S3產生的黑色素與已知黑色素共性相符合，具有良好的開發潛力，對其產黑色素的發酵條件將做進一步研究。

致謝：本研究菌株的電鏡照片由國家海洋局第三海洋研究所谷力老師拍攝，16S rDNA的拼接由廈門大學生命科學學院羅晶晶完成，在此一并表示感謝！

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（責任編輯 ?張 ?毅）

在培養特征和生理生化特征方面，除了對鼠李糖利用不同外，菌株S3與S. puniciscabiei完全一致。在LB及黃豆粉培養上不產生抗菌活性物質，不具有植物病害生物防治潛力，對其是否引起馬鈴薯瘡痂病有待進一步研究，菌株S3產生的黑色素與已知黑色素共性相符合，具有良好的開發潛力，對其產黑色素的發酵條件將做進一步研究。

致謝：本研究菌株的電鏡照片由國家海洋局第三海洋研究所谷力老師拍攝，16S rDNA的拼接由廈門大學生命科學學院羅晶晶完成，在此一并表示感謝！

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（責任編輯 ?張 ?毅）