嬰兒雙歧桿菌凍干保護劑配方的篩選與優化

沈頤涵

摘 ? 要 ? 目的：構建一種更好的嬰兒雙歧桿菌微生態制劑生產工藝，提高凍干菌粉的活菌存活率。方法：通過正交試驗，對嬰兒雙歧桿菌凍干過程中加入的保護劑種類及其最佳配比進行研究。結果：以脫脂奶粉10 %，甘露醇3 %，Vc-Na 1 %，味精0.5 %作為凍干保護劑，可使嬰兒雙歧桿菌凍干菌粉的活菌存活率由43%左右提高到85.42 %、活菌量保持在4.1×1010 cfu/g。結論：該配方用于微生態制劑的生產將有較好的效益。

關鍵詞 ? ?嬰兒雙歧桿菌 ? ?冷凍干燥 ? ?凍干保護劑 ? ?正交試驗

中圖分類號：R944.9 ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ?文章編號：1006-1533（2014）23-0066-05

Screening and optimization of the formulation of cryoprotectants

for the lyophilized Bifidobacterium infantis

SHEN Yihan*

（Department of Quality Assurance， Shanghai SINE Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China）

ABSTRACT ? Objective： To develop a better technique for the production of probiotic Bifidobacterium infantis and improve the survival rate of the lyophilized powder. Methods： In this improved technique， The types of cryoprotectants added in the lyophilization of Bifidobacterium infantis and their optimized formulations were studied by orthogonal test. Results： The survival rate of the lyophilized powder of Bifidobacterium infantis could be significantly improved from about 43% to 85.42% and the viable cell counts maintained at above 4.1×1010 cfu/g when a formulation of cryoprotectant consisting of 10% skim milk powder， 3% mannitol， 1% Vc-Na and 0.5% monosodium glutamate was used. Conclusion： This formulation will have a good benefit when applied to the probiotic production.

KEY WORDS ? ?Bifidobacterium infantis; lyophilization; cryoprotectant; orthogonal test

越來越多的科學研究表明，益生菌有益于人體的健康[1]。雙歧桿菌是人腸道中重要的益生菌，具有調節微生態平衡的生理功能。雙歧桿菌屬專性厭氧菌，對培養環境敏感，對營養要求苛刻，活性保持較難。如何最大限度地保持雙歧桿菌制品的活性已成為研究熱點之一。以雙歧桿菌制成的微生態制劑主要依賴于發酵制備和凍干保藏技術。一些對雙歧桿菌凍干菌粉的研究結果表明，雙歧桿菌發酵制備的高密度菌體經歷凍干后，菌體密度基本呈指數級下降[2]。因此需要改進凍干保護劑配方以提高菌體的凍干存活率及嬰兒雙歧桿菌制劑的產品質量。在適當保護劑的作用下，采用冷凍干燥技術能有效地保藏發酵制劑[3-7]。但是大量的研究顯示保護劑的效果存在菌株特異性[8-11]。Leslie等[3]發現海藻糖對大腸桿菌和蘇云金桿菌有良好的保護效果，而Linden等[12]的研究中海藻糖對植物乳桿菌卻沒有保護作用。因此，凍干保護劑的選擇在新開發益生菌制劑的應用中尤為重要。在我廠目前工藝條件下，經過凍干后嬰兒雙歧桿菌的凍干菌粉活菌數為2.0×1010 cfu/g左右，存活率僅為43%左右。本研究在其他條件固定的前提下，根據保護劑的種類通過正交試驗優化篩選獲得嬰兒雙歧桿菌的最佳凍干保護劑配比，旨在構建一種改進的微生態活菌制劑生產工藝，用于嬰兒雙歧桿菌產品的生產。

材料與方法

主要材料

菌種：嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis），由我公司藥物研究所微生態制品研究室保藏。

種子培養基配方（g/L）：脫脂奶粉40、無水葡萄糖10、酵母膏10、硫酸銨2.5、磷酸二氫鉀0.75、磷酸氫二鉀1.5，異構化乳糖液5，pH 7.0。

發酵培養基配方（g/L）：胰蛋白胨10、酵母粉10、牛肉膏5、葡萄糖5、乳糖10、磷酸二氫鉀2、硫酸鎂0.5、硫酸亞鐵0.05、L-半胱氨酸0.25，pH 6.5。

凍干保護劑配料：脫脂奶粉、甘露醇、Vc-Na、味精、異乳糖。

儀器設備

5 L、50 L發酵罐及配套系統（上海國強生化工程裝備有限公司）;GQ75B高速管式離心機（上海浦東天本離心機械有限公司）;Lyo-002Bb真空冷凍干燥機（Tofflon）;培養箱（Binder）;PHS-3E型精密pH計（上海雷磁）;Cary 50紫外分光光度計（Varian）;BP3100s電子分析天平（Sartorius）;滅菌鍋（Tony）;厭氧產氣袋（梅里埃）。

試驗方法

菌種活化、傳代與接種：選用血瓊脂平板培養基活化保藏的菌種，置于37 ℃厭氧培養48 h，挑單菌落制備皰肉管。

種子液制備：將培養好的皰肉管接種于400 ml種子培養液中，在37±1 ℃條件下培養12～18 h，按10 %接種量接種至4 L種子培養液中，在37±1 ℃條件下培養12～18 h。

菌粉的制備：將培養好的種子液按10 %接種量接種于50 L發酵罐中，在37±1 ℃，攪拌轉速180 r/min條件下發酵培養8～10 h;發酵菌液于4 ℃、10 000 r/min離心15 min，去掉上清液得菌體;然后根據離心獲得的菌體重量，按菌泥保護劑1∶1的比例，依次加入各類凍干保護劑，混勻后置于真空冷凍干燥機-38 ℃預凍5 h，再冷凍干燥約33 h，期間程序升溫至30 ℃，出箱后即得凍干菌粉，并檢測有效活菌數。

活菌數測定：采用血瓊脂平板計數法，梯度稀釋至約20～160個菌/ml后涂平板，置于37±1 ℃培養箱中厭氧培養48 h后計數;同時，用營養瓊脂培養基進行雜菌檢測。

凍干存活率計算方法：凍干菌粉活菌數/加混合保護劑凍干前的活菌數×100%。

結果與討論

凍干保護劑的選擇

大分子保護劑的選擇與優化

真空冷凍干燥過程中，冷凍和干燥兩個過程會造成部分微生物細胞的損傷、死亡以及某些酶蛋白分子的鈍化，選擇有效的保護劑是解決這一問題的技術關鍵。不同的保護劑在冷凍干燥過程中發揮著不同的作用，大分子類保護劑主要在細胞表面起保護層作用，防止細胞受損。脫脂奶粉能穩定細胞膜，提供細胞保護衣以免細胞受到損傷。它不管單獨使用還是與其他保護劑混合使用均具良好效果。一些大分子物質如淀粉、麥芽糊精等，對菌體也具有較好的非滲透保護作用。為此，對10%含量的脫脂奶粉、淀粉和麥芽糊精進行篩選（表1），結果表明，麥芽糊精的保護效果最差，而脫脂奶粉的保護效果優于淀粉，因此選擇脫脂奶粉為大分子保護劑。進一步對脫脂奶粉的添加量進行優化（圖1），發現隨著脫脂奶粉添加量的增加，嬰兒雙歧桿菌凍干存活率有所提高。綜合考慮凍干進箱的液體體積以及脫脂奶粉的溶解性，選擇10 %的脫脂奶粉添加量為宜。

小分子保護劑的選擇與優化

糖類的保護作用是因為在冷凍過程中由于糖類形成氫鍵能力較強，穩定蛋白質的高級結構，防止蛋白質變性，使其即使在低溫冷凍和干燥失水的情況下，仍保持蛋白質結構與功能完整性。試驗對含量6%的蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘油和異乳糖進行篩選（表2），結果表明，被譽為雙歧因子的異乳糖的凍干保護效果并不比甘露醇和甘油好;而用甘油作保護劑凍干獲得的菌粉，相對較為潮濕，凍干保護效果也沒有甘露醇好;因此選擇甘露醇作為小分子保護劑。對甘露醇進行單因素優化試驗，結果如圖2所示，隨著甘露醇濃度的提高，菌體的凍干存活率有所上升。當甘露醇濃度提高到一定程度后，嬰兒雙歧桿菌的凍干存活率呈一定的下降趨勢。這可能是由于甘露醇凍干后結晶水較多并會析出，如果條件控制不好，會使菌體死亡。因此添加過多的甘露醇會影響凍干菌粉的存活率，故選擇5 %的甘露醇含量為宜。

氧化還原保護劑的選擇與優化

嬰兒雙歧桿菌是專性厭氧微生物，對氧極其敏感，所以降低嬰兒雙歧桿菌存在體系中的氧化還原電勢對其活力的保持尤為重要。Vc-Na能降低凍干保護劑的氧化還原電位，并消耗凍干過程中的部分氧氣。試驗對含量0.5%的Vc-Na、味精和L-半胱氨酸進行篩選（表3），結果表明，L-半胱氨酸的凍干保護效果最差，Vc-Na的凍干保護效果略為優于味精。為增強保護劑的抗氧化效果，選擇Vc-Na和味精作為復合氧化還原保護劑，并對Vc-Na和味精的保護劑濃度分別進行優化（圖3），結果表明，隨著Vc-Na濃度的增加，嬰兒雙歧桿菌的凍干存活率有一定的提高，當Vc-Na濃度達到一定程度后，菌株的凍干存活率呈緩慢上升趨勢，故選擇Vc-Na的含量為1 %。隨著味精含量的提高，菌株的存活率有一定的提升，但更高濃度的味精對提高菌粉的存活率效果不明顯，故選擇味精的含量為0.5 %。

凍干保護劑配方的優化

單一的保護劑并不能滿足冷凍干燥的要求，所以凍干保護劑一般都是按一定配比混合使用的。復合保護劑中的各成分在冷凍干燥中均發揮著各自的作用，同時相互間又具有協同作用，只有在比例及濃度達到協調時，才能達到最佳的保護效果[10]。為了確定嬰兒雙歧桿菌真空冷凍干燥的最佳凍干保護劑配比，以菌體凍干存活率作為檢測指標，用通過單因素篩選試驗獲得的保護劑種類及優選含量設計復合凍干保護劑正交試驗（表4），以期最大限度的發揮凍干保護劑的功能，減少菌體在真空冷凍干燥過程中的損傷。綜合考察后最終選擇最佳凍干保護劑配比方案為A1B1C2D1（表5）。即由10%脫脂奶粉、3%甘露醇、1% Vc-Na和0.5%味精組成混合凍干保護劑。為驗證正交試驗結果的可靠性，采用上述優化配方進行試驗，實際測得加入混合保護劑時嬰兒雙歧桿菌的活菌量為4.8×1010 cfu/ml，而凍干后的菌粉活菌量為4.1×1010 cfu/g，凍干存活率約為85.42 %，表明正交試驗所得出的最佳凍干保護劑配比可行。

凍干菌粉穩定性考察

目前我廠的凍干菌粉有效期為3個月（密封裝袋于2～8 ℃冷庫保存），在近效期時菌粉的活菌數基本接近5.0×108 cfu/g。取通過上述優化方法生產的3批凍干菌粉，密封裝袋后置于2～8 ℃冷庫內，進行為期3個月的穩定性試驗，用血瓊脂平板計數法進行檢測，考察其活菌數的變化趨勢（表6）。結果表明，經過3個月的穩定性試驗，凍干菌粉的活菌數均大于企業的標準，符合要求。因此，可以認為優化的凍干保劑配方具有生產實用性。

討論

目前的許多研究發現，由于雙歧桿菌受自身的生長特性及周圍環境因素的影響，導致冷凍干燥產品中的有效活菌數量會隨時間及儲存條件而急劇下降，最終影響產品的使用效果。本試驗通過正交優化獲得的最佳凍干保護劑配方，使菌粉的活菌存活率達到85.42 %，保存3個月的活菌數能夠基本保持在8.0×108 cfu/g，達到產品合格的質量標準。本研究僅對凍干保護劑的配方進行了優化，未對凍干工藝參數進行整體優化，因此，后續可以通過對凍干工藝參數的優化，以達到進一步提升菌粉活菌數目的。綜上所述，采用該復合凍干保護劑配方進行真空冷凍干燥，可極大程度減少活菌量指數級下降情況的發生，提高菌粉中的活菌量，具有很好的應用潛力。

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（收稿日期：2014-07-17）

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（收稿日期：2014-07-17）