麻瘋樹籽殼總黃酮的提取及其羥基自由基清除作用

馬 博 張婷婷 黎遠成 仝海娟

（百色學院化學與生命科學系，廣西 百色 533000）

麻瘋樹（JatrophacurcasL.）為大戟科麻瘋樹屬多年生灌木或小喬木植物，別名膏桐、小桐子等。因其種子油脂組成與其它植物油脂相似，且含油量高而成為一種重要的生物能源樹種，加上麻瘋樹抗逆性強，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區，成為一種備受青睞的非糧木本油料作物［1］。據報道［2，3］，到2015年全球麻瘋樹種植面積將達1 280萬hm2，中國將達800萬hm2，那么屆時將生產大量的麻瘋樹種子。此外，麻瘋樹在民間可全株入藥［4，5］。目前，國內外學者已從麻瘋樹的根莖葉等部位分離得到包括黃酮類在內的多種生物活性物質。其中，已報道的麻瘋樹葉中黃酮類物質有牡荊素、異牡荊素、芹素、5，4′-二羥-6，7葡萄糖苷黃酮及5－羥-3，7，4′-鼠李糖苷黃酮；根中黃酮類物質有5－羥基吡咯-2-酮，嘧啶-2，4-酮及川皮苷；莖皮中黃酮類物質有5，4′-二甲羥基-3，7，3′-三甲氧基黃酮，5，3′，4′-三羥基-3，7-二甲氧基黃酮及槲皮素-3-甲醚；籽粕中黃酮類物質有嘧啶-2，4-酮，3′-甲氧基黃酮及胡蘿卜苷［6－8］。此外，范樹國等［9］用3種不同方法測定了麻瘋樹中的總黃酮含量，并比較了根莖葉的黃酮含量；Zhang等［10］利用響應面法優化了麻瘋樹葉中總黃酮的提取工藝，并對其抗菌活性進行了研究。麻瘋樹籽殼為其種子硬化的外種皮，當前有關其黃酮的研究還未見有報道。本研究擬針對麻瘋樹籽殼中的總黃酮，通過正交試驗優化其提取條件，并研究其提取物（JCF）的羥基自由基（·OH）清除能力，旨在為今后麻瘋樹籽殼的資源化利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

麻瘋樹籽：FD-8號，廣西南寧富民達生物能源科技有限公司；

2，6-二 叔 丁 基-4-甲 基 苯 酚 （butylated hydroxytoluene，BHT）：色譜純（＞99.0%），阿拉丁化學試劑有限公司；

蘆丁標準品：純度＞98.0%，國藥集團化學試劑有限公司；

抗壞血酸（Vc）：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

鄰菲啰啉和硫酸亞鐵：分析純，天津市光復科技發展有限公司；

硝酸鋁：分析純，廣東光華科技股份有限公司；

亞硝酸鈉：分析純，天津市福晨化學試劑廠；

無水乙醇：分析純，西隴化工公分有限公司；

石油醚（30～60℃）：分析純，天津市富宇精細化工有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

紫外可見分光光度計：UV-2700型，日本島津公司；

電子分析天平：FA2004型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

高速冷凍離心機：TGL-16M型，湘儀離心機儀器有限公司；

旋轉蒸發儀：RE-52型，上海亞榮生化儀器廠；

真空泵：SHB-Ⅲ型，鄭州世紀雙科實驗儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋：HH-S2型，金壇市醫療儀器廠；

鼓風干燥箱：DHG-9146A型，上海精宏實驗設備有限公司；

中藥粉碎機：LD-200型，長沙常宏制藥機械設備廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理 種子去雜除塵后脫仁，籽殼置于電熱鼓風干燥箱內50℃干燥72h，粉碎、過60目篩，石油醚索氏回流脫脂12h、揮干石油醚，將其4℃保藏、備用。

1.2.2 總黃酮提取 取適量麻瘋樹籽殼粉末，置于圓底燒瓶中，在一定溫度下用不同濃度和體積的乙醇溶液回流提取一段時間后，抽濾、定容。

1.2.3 總黃酮含量測定 采用亞硝酸鈉—硝酸鋁—氫氧化鈉顯色法［11］。修改如下：分別精密量取0.2mg/mL蘆丁溶液（30%乙醇制）0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，置入25mL容量瓶中，各加1.0mL 5%的NaNO2溶液，混勻后靜置6min；再各加1.0mL 10%的 Al（NO3）3溶液，混勻，靜置6min；最后各加10mL 4%的NaOH溶液，混勻，30%乙醇溶液定容，靜置15min。以空白試劑為對照，在510nm處測定各自吸光度，再以吸光度為縱坐標、以蘆丁的不同質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，所得回歸方程為Y＝0.439 7x－0.000 5，R2＝0.999 8，線性范圍為0.2～1.0mg/mL。

1.2.4 總黃酮得率計算 取1.0mL麻瘋樹籽殼總黃酮提取液，置入25mL容量瓶中，按照1.2.3方法測定總黃酮提取液的吸光度，并代入回歸方程，求出麻瘋樹籽殼提取液中總黃酮的質量濃度。代入式（1）計算麻瘋樹籽殼中總黃酮的含量。

式中：

R——總黃酮得率，%；

c——提取液中黃酮濃度，mg/mL；

v——黃酮提取液體積，mL；

n——稀釋倍數；

m——麻瘋樹籽殼質量，g。

1.2.5 單因素試驗設計

（1）乙醇濃度對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響：在料液比1∶30（m∶V），乙醇濃度40%，50%，60%，70%，80%，7 0℃回流提取2.0h的條件下，考察提取溶劑乙醇濃度對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響。

（2）提取時間對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響：在料液比1∶30（m∶V），乙醇濃度60%，70℃回流提取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h的條件下，考察提取時間對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響。

（3）料液比對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響：在料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50（m∶V），乙醇濃度60%，7 0℃回流提取時間2.5h的條件下，考察料液比對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響。

（4）提取溫度對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響：在料液比1∶30（m∶V），乙醇濃度60%，分別于40，50，60，70，80，85，90，95℃回流提取2.5h的條件下，考察提取溫度對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響。

1.2.6 正交試驗設計 在單因素試驗結果的基礎上，確定正交試驗所用因素的3個水平，按照L9（34）正交試驗表進行設計，每個條件組合平行3次試驗。

1.2.7 羥基自由基（·OH）清除試驗 采用鄰二氮菲—Fe2＋＋H2O2氧化法［12］。0.75mmol/L的鄰二氮菲 溶液1.0mL，加入0.2mol/L的PBS 2.0mL和不同質量濃度的麻瘋樹籽殼總黃酮溶液1.0mL，混勻，加入0.75mmol/L的F eSO4溶液1.0mL，立即混勻。再加入0.01%（V/V）H2O2溶液1.0mL啟動反應，37℃恒溫水浴1.0h后，于536nm處測定吸光度，記錄為A樣，用1.0mL蒸餾水代替不同質量濃度麻瘋樹籽殼總黃酮溶液，其余步驟同上，測得吸光度記錄為A損，用2.0mL蒸餾水分別代替H2O2和不同質量濃度麻瘋樹籽殼總黃酮溶液，其余步驟同上，測得吸光度記錄為A未，平行3次。按式（2）計算·OH清除率（η1）：

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響 隨著乙醇濃度增加，溶劑滲透力增強，弱極性黃酮得率也隨之增加；當乙醇達到一定濃度后，弱極性黃酮溶出達到動態平衡，而極性黃酮得率卻不斷減少，加上色素、鞣質等脂溶性雜質與弱極性黃酮競爭溶劑，致使其向主體溶劑擴散速度減慢，致使黃酮總得率降低。由圖1可知，乙醇濃度為60%時，黃酮提取得率達到最大，故選擇乙醇濃度60%作為后續單因素試驗條件。

圖1 乙醇濃度對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響Figure 1 Effect of alcohol concentration on the total flavonoids yield of Jatropha curcus L.seed shell

2.1.2 提取時間對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響 黃酮提取是一個傳質過程，平衡需要一定時間。如果時間過短，傳質平衡未達到，黃酮提取得率就偏低；當傳質過程基本平衡后，再延長提取時間，黃酮得率也不會有顯著增加，而熱穩定性較差的黃酮卻一直在降解。由圖2可知，隨著提取時間的增加，黃酮得率也不斷上升；但超過2.5h后，麻瘋樹籽殼總黃酮的得率有所下降，故選擇提取時間2.5h作為后續單因素試驗條件。

圖2 提取時間對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響Figure 2 Effect of extraction time on the total flavonoids yield of Jatropha curcus L.seed shell

2.1.3 料液比對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響 由圖3可知，隨著料液比的增加，黃酮提取得率不斷增加，達到1∶30（m∶V）后，黃酮得率增加不明顯。這是因為料液比增加，物料與溶劑之間黃酮濃度差增大，傳質阻力變小，有利于黃酮的溶出；但料液比達到一定比例后，黃酮基本溶出，再增加料液比，黃酮得率變化不大，且物耗和能耗增加，不利于黃酮后續精制。故選擇料液比1∶30（m∶V）作為后續單因素試驗條件。

圖3 料液比對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響Figure 3 Effect of ratio of solid to liquid on the total flavonoids yield of Jatropha curcus L.seed shell

2.1.4 提取溫度對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響 溫度升高，分子運動加劇、溶劑黏度降低、傳質過程加快，有利于溶質擴散和溶劑滲透，進而有助于麻瘋樹籽殼總黃酮的提取。由圖4可知，麻瘋樹籽殼總黃酮提取得率隨著提取溫度上升而增加，90℃時達到最大，為6.576%。試驗過程中發現，60%乙醇在85～90℃時核狀沸騰，95℃時膜狀沸騰，溶劑損失大、雜質溶出較多，不利于黃酮溶出，黃酮得率減少。故選取85℃作為后續試驗優化的條件。

圖4 提取溫度對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響Figure 4 Effect of extraction temperature on the total flavonoids yield of Jatropha curcus L.seed shell

2.1.5 提取次數對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響 由圖5可知，第1次黃酮提取得率為6.379%，占3次黃酮提取得率之和的89.5%。考慮到試驗可行性，以及減小試驗誤差，故確定后續正交試驗提取1次。

2.2 正交試驗優化結果與分析

根據單因素試驗結果，確定了乙醇濃度、提取時間、料液比及提取溫度4個因素的水平（表1），進行L9（34）正交試驗。正交試驗結果見表2。

圖5 提取次數對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響Figure 5 Effect of extraction times on the total flavonoids yield of Jatropha curcus L.seed shell

表1 正交試驗因素水平Table 1 Levels of orthogonal test factors

表2 正交試驗結果與分析Table 2 Results of orthogonal test

由正交試驗結果的極差R可以看出，麻瘋樹籽殼的總黃酮提取得率影響因素大小依次為提取溫度、料液比、提取時間和乙醇濃度。最佳的因素組合為A1B3C3D2，即乙醇濃度50%、提取時間3.0h，料液比1∶40（m∶V），提取溫度85℃。

2.3 驗證實驗

在最佳的提取因素組合（A1B3C3D2）條件下，進行3次平行試驗，麻瘋樹籽殼的總黃酮平均得率為6.61%，RSD為1.9%，大于L9（34）正交試驗表所有因素組合的試驗結果，表明本試驗優化的提取條件較為可靠，重現性好，達到了優化的目的。

2.4 羥基自由基清除作用

·OH作為一種得電子極強的活性氧，能夠使脂質過氧化、核酸斷裂及其它生物大分子降解等，對生物機體危害極大。麻瘋樹籽殼總黃酮的·OH清除作用見圖6。在測定的質量濃度范圍內，麻瘋樹籽殼提取物與對照Vc和BHT的·OH清除能力均隨著質量濃度的上升而增強，且存在劑量依賴關系；但在相同質量濃度下，麻瘋樹籽殼乙醇提取物的·OH清除率均比Vc和BHT大，其黃酮半數抑制濃度（IC50）為0.130mg/mL，分別大于 Vc和BHT的0.164mg/mL和0.462mg/mL。當麻瘋樹籽殼提取物中的黃酮質量濃度為0.3 mg/mL時，其·OH清除率達89.95%，說明麻瘋樹籽殼提取物具有很強的·OH清除能力。

圖6 麻瘋樹籽殼乙醇提取物對羥基自由基的清除作用Figure 6 Scavenging activity of ethanol extract from Jatropha curcus L.seed shell on hydroyxl radicals

3 結論

本試驗利用回流法優化了麻瘋樹籽殼中的總黃酮提取工藝，提取因素乙醇濃度、提取時間、料液比及提取溫度對麻瘋樹籽殼總黃酮得率的影響依次增大，最佳提取工藝組合為乙醇濃度50%、提取時間3.0h，料液比1∶40（m∶V），提取溫度85℃；在此條件下總黃酮提取平均得率為6.61%，高于文獻［9］報道的麻瘋樹根、莖、葉的3.055 0%，0.422 0%，4.874 5%。另外，麻瘋樹籽殼黃酮提取物具有較強的·OH清除力，其IC50為0.130mg/mL，分別高于抗氧化劑Vc和BHT。鑒于以上結果，麻瘋樹籽殼可以作為天然抗氧劑的生產原料。但今后還有必要對麻瘋樹籽殼中的黃酮進行分離純化與結構表征，通過體內與體外方法更為全面評價其抗氧化性能，以便更深入的了解麻瘋樹籽殼黃酮與其抗氧化性能之間的構效關系。

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