高水解率低乳糖奶的褐變抑制研究

伍桃英 程云輝 曾知音 歐陽林 趙良忠

（1.長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410114；2.邵陽學院生物與化學工程系，湖南 邵陽 422000；3.邵陽醫學高等專科學校附屬醫院，湖南 邵陽 422000）

乳糖酶缺乏和乳糖不耐受癥是一個世界性的問題，目前解決這個問題的方法主要是飲用酸奶和低乳糖奶制品［1］。酸奶中的乳酸菌能使牛奶中乳糖部分水解［2］，但是酸奶的保質期短，需要冷鏈儲運、銷售，生產成本高，因此，利用外源性β-半乳糖苷酶制備低乳糖奶被視為最有效的方法［3，4］。低乳糖生產過程中，乳糖被分解為葡萄糖和半乳糖，一方面增加了甜度，賦予低乳糖奶良好的口感和風味；另一方面，大量還原糖中的羰基與賴氨酸中的氨基結合發生美拉德反應易導致產品褐變［5］，因此，抑制低乳糖奶的褐變成為生產低乳糖奶的關鍵技術之一。

本研究擬利用β－半乳糖苷酶水解生產低乳糖奶，采用紫外分光光度法測定美拉德反應的主要中間產物5-HMF的含量，并以此為依據對6種褐變抑制劑進行篩選，同時結合滅菌條件，對其進行正交優化，研究褐變抑制劑的添加量與5-HMF的關系，旨在生產出營養與感官俱佳的低乳糖奶。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂奶粉：湖南亞華乳業有限公司；

β－半乳糖苷酶：Lactozyme，諾維信（中國）生物技術有限公司；

5－羥甲基糠醛：優級純，北京百靈威科技有限公司；

乙二胺四乙酸二鈉：分析純，Sanland-chem International Inc.；

亞硫酸鈉：分析純，長沙市國營延風化學試劑廠；

亞硫酸氫鈉：分析純，天津市申泰化學試劑有限公司；

Vc：分析純，衡陽市凱信化工試劑有限公司；

L－半胱氨酸：生物試劑，國藥集團化學試劑有限公司；

檸檬酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

試驗用水為蒸餾水。

1.2 主要儀器設備

紫外可見分光光度計：UV754N型，上海精密科學儀器有限公司；

臺式pH計：Delta320型，上海君達儀器儀表有限公司；

電子分析天平：FA2004N型，上海精密科學儀器有限公司；

可調式移液槍（20～200μL）：Finnpipette型，熱電（上海）儀器有限公司；

電熱恒溫干燥箱：CS202型，重慶實驗設備廠；

數顯恒溫水浴鍋：HH型，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程 利用乳糖酶水解復原乳中的乳糖，制備低乳糖奶，工藝流程：

1.3.2 操作要點

（1）配制復原乳：以全脂奶粉∶水（1∶7）的比例配制成復原乳，采用碘量法［6］測定乳糖含量。

（2）乳糖水解：復原乳經95℃/15s殺菌后冷卻到適宜溫度，添加1.50‰（［E］/［S］）的β－半乳糖苷酶，于38.15℃水解3.0h制備低乳糖奶，乳糖水解率α按式（1）計算。

式中：

α——乳糖水解率，%；

cs——Na2S2O3標準液的濃度，mol/L；

c0——單質碘標準溶液的濃度，mol/L；

V0——測定時準確移取的單質碘的體積，mL；

V1、V2——分別為水解前、后牛奶濾液消耗Na2S2O3的體積，mL。

（3）添加褐變抑制劑：褐變抑制劑加入過早會影響乳糖酶的活性，加入過晚起不到褐變抑制的效果，擬在水解結束前20min加入一定量的褐變抑制劑溶液。

1.3.3 紫外分光光度法測定5-HMF的含量

（1）5-HMF標準曲線的制作：稱取一定量的5-HMF配成標準品儲藏液，并用水稀釋成0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0μg/mL的標準品工作液，用紫外分光光度計測定其2 85nm波長下的吸光值（OD285）［7］。

（2）樣品中5-HMF含量的測定：用Pb（Ac）2與COOKNa2HPO4作為乳品中蛋白質沉淀劑，取樣品預處理后的濾液或濾液的稀釋液，用紫外可見分光光度計測其吸光值OD285。褐變抑制率的計算公式見式2。

式中：

γ——褐變抑制率，%；

xa——未添加褐變抑制劑樣品中5-HMF的含量，μ g/mL；

xb——添加了褐變抑制劑樣品中5-HMF的含量，μ g/mL。

2 結果與討論

2.1 低乳糖奶中乳糖的水解率

以全脂奶粉∶水（1∶7）的比例配制成復原乳，復原乳中的乳糖含量為4.82%。在滅菌后的復原乳中添加β－半乳糖苷酶對其進行水解，經測定，低乳糖奶其水解率達92.67%。

2.2 5-HMF標準曲線

以5-HMF的濃度為橫坐標、吸光值OD285為縱坐標繪制標準曲線，見圖1。

圖1 5-HMF的標準曲線Figure 1 Standard curve of 5-hydroxymethylfurfural

由圖1可知，其標準曲線方程為：y＝0.123 7x，R2＝0.999 8，5-HMF濃度（x）與吸光值（y）相關性良好。

2.3 單一褐變抑制劑的篩選

根據文獻［8～10］，選擇 Na2SO3、NaHSO3、Vc、EDTA-2Na、L-半胱氨酸、檸檬酸6種物質作為褐變抑制劑，加入量以其占牛乳的體積百分比表示（%，m/V），以未加褐變抑制劑的低乳糖奶樣品為空白，用紫外分光度法檢測5-HMF，研究不同褐變抑制劑對褐變抑制率的影響，結果見圖2。

圖2 不同種類的褐變抑制劑對褐變抑制率的影響Figure 2 The anti-browning effect of different types of browning inhibitors

5-HMF的積累與褐變有很大的相關性，其濃度越小，褐變抑制率越大，說明褐變抑制效果越好。由圖2可知：Na2SO3、EDTA-2Na、NaHSO3、檸檬酸對5-HMF有不同程度的抑制作用，而在低乳糖奶中，Vc和L－半胱氨酸對5-HMF的生成有促進作用，具體如下：

（1）Na2SO3對5-HMF的抑制效果隨其濃度的增加而增強，當其用量在0.01%～0.20%時，褐變抑制率從0.73%線性增長至11.69%。Na2SO3具有抑制褐變效果主要由于它能不可逆地與醌生成無色的加成產物，且具有抑制微生物生長的作用，這對低乳糖奶的生產有利。

（2）NaHSO3在0.01%～0.10%范圍內對低乳糖奶中5－HMF的抑制效果隨用量的增加而遞增；當NaHSO3大于0.10%時，NaHSO3對5-HMF的抑制效果增幅開始減小。這是由于NaHSO3的抗褐變機理是其吸水后，釋放出SO2，生成亞硫酸，亞硫酸能與許多有色物質發生加成反應形成加成物，使有色物失去雙鍵或減少雙鍵，同時亞硫酸還可以將某些生色基團封閉起來，避免生色反應的發生，因而NaHSO3具有褐變抑制效果；但亞硫酸易分解，因此即使持續增加NaHSO3的用量，而體系中的亞硫酸并未繼續增加，所以對5-HMF的抑制效果并不會持續上升。

（3）Vc是一種水溶性維生素，在氧化還原中能起調節作用。在此研究中，Vc對低乳糖奶中5-HMF不僅沒有產生抑制作用，反而具有很強的促進作用。這是由于Vc在溶液中加熱自身容易氧化分解，生成的己糖加速了Maillard反應進程［11］。

（4）EDTA-2Na對5-HMF的抑制效果隨著濃度的增加呈現先增后減的變化趨勢。當EDTA-2Na的用量在0.01%～0.10%，褐變抑制率由1.09%快速上升至7.67%；當EDTA-2Na大于0.10%時，對5-HMF的抑制效果開始減弱。這是由于EDTA-2Na不僅能與促進褐變的金屬離子螯合，還能與乳及乳制品中的鈣離子反應，當EDTA-2Na的用量過多時，EDTA-2Na不僅能結合游離鈣，而且能從膠體磷酸鈣、酪蛋白中爭奪鈣離子，破壞乳體系原有的膠體平衡，從而加速了褐變的發生［12］。

（5）在0.01%～0.125%范圍內，檸檬酸對5-HMF的抑制效果呈拋物線變化趨勢。當檸檬酸用量小于0.075%時，對5-HMF的褐變抑制率呈上升趨勢；當其用量大于0.075%時，對5-HMF的褐變抑制率開始下降。由此可知，低濃度的檸檬酸對低乳糖奶中5-HMF起抑制作用，而高濃度的檸檬酸促進5-HMF的生成。

（6）L-半胱氨酸屬于含硫氨基酸。L-半胱氨酸在濃度為0.004%附近時，對5-HMF有微弱的抑制效果；在其他濃度反而具有較大的促進作用，因此，不選用L-半胱氨酸作為低乳糖奶的褐變抑制劑。本試驗的研究結果與牛樂寶等［13］研究結果相吻合，在后者研究的褐變抑制劑配方中，L-半胱氨酸的添加量為0g/kg。

2.4 褐變抑制劑加入時間的研究

為了探索褐變抑制劑是否影響乳糖酶的水解作用，本試驗設計在水解開始的0，40，80，160min 4個時間點加入褐變抑制劑，考察0.2%Na2SO3、0.1%EDTA-2Na、0.1%NaHSO3、0.075%檸檬酸對乳糖水解率和褐變抑制率的影響，確定最佳添加時間。

2.4.1 加入時間對乳糖水解率的影響 褐變抑制劑的加入導致pH值的變化會影響乳糖酶的水解效果。由表1可知，褐變劑加入時間越晚，乳糖的水解率越大，這是由于乳糖酶的酶活力受褐變抑制劑的影響，從而反應在乳糖的水解率上。因此，為保證乳糖水解率達到90%，褐變抑制劑加入的時間接近水解結束的時間較好。

表1 加入時間對乳糖水解率的影響Table 1 Effect of added time on the hydrolysis rate of lactose /%

2.4.2 加入時間對褐變抑制率的影響 體系中5-HMF的濃度是考察各褐變抑制劑抑制效果的重要指標，其濃度越低，說明褐變劑的抑制效果越好，抑制率也就越大。由表2可知，隨著各種褐變劑加入時間的延后，其抑制率皆逐漸增大。

綜上所述，褐變抑制劑加入的時間越晚，對牛乳體系pH和乳糖水解率的影響越小，由于褐變抑制劑過早加入并未提高褐變抑制率，因此，在反應體系結束水解前20min加入即可。這與李杰［14］的觀點相同。

表2 加入時間對褐變抑制率的影響Table 2 Effect of added time on the anti-browning rate/%

2.5 復配褐變抑制劑的研究與驗證

根據單一褐變抑制劑的試驗結果，選擇EDTA-2Na、檸檬酸、Na2SO3、NaHSO34種（表3）褐變抑制效果較好的褐變抑制劑進行正交試驗，結果見表4。

由表4可知，以褐變抑制率為考察指標，4個因素的主次關系是C＞B＞D＞A，較優方案為C4B2D2A3，即0.20%Na2SO3＋0.025% 檸 檬 酸 ＋0.05%NaHSO3＋0.075%EDTA-2Na。

對C4B2D2A3復配方案進行驗證，結合殺菌溫度考察其褐變抑制效果，結果見表5。

表3 L16（44）正交設計Table 3 L16（44）orthogonal design

表4 L16（45）正交試驗結果Table 4 The results of orthogonal test L16（45）

表5 復配褐變抑制劑的驗證結果Table 5 Verify results of compound browning inhibitor

由表5可知，殺菌溫度越高，復配褐變抑制劑的褐變效果越明顯，當殺菌溫度為100℃時，其褐變抑制率將近40%。

3 結論

采用β－半乳糖苷酶制備的低乳糖奶其乳糖水解率超過90%，針對于低乳糖奶的褐變，篩選出了Na2SO3、檸檬酸、NaHSO3、EDTA-2Na 4種效果相對較好的褐變抑制劑，在水解結束前20min加入褐變抑制即可。對褐變抑制劑進行復配，正交優化得到的較優配比為0.20%Na2SO3＋0.025%檸檬酸＋ 0.05%NaHSO3＋ 0.075%EDTA-2Na，配合1 0min/100℃的殺菌條件，其褐變抑制率將近40%，說明本試驗所研究的復配褐變抑制劑具有明顯的褐變抑制效果，對生產具有理論指導，有利于促進低乳糖奶的進一步發展。

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