酶法提取魚鱗膠原蛋白的工藝優(yōu)化

梅鑫東 曾江南 蔣柏泉

(1.江西省化學(xué)工業(yè)學(xué)校，江西南昌 330012;2.南昌大學(xué)環(huán)化學(xué)院，江西 南昌 330031)

膠原蛋白具有良好的生物相容性、低抗原性和免疫原性以及良好的輔助細胞再生功能，已被廣泛用于食品、生物醫(yī)學(xué)、制藥和化妝品等領(lǐng)域［1］。膠原蛋白在食品工業(yè)中主要用于肉制品和冷凍食品的改良劑、飲料的澄清劑、乳制品和糕點糖果的添加劑，人造腸衣、食品包裝膜和食品涂層材料等。魚鱗是魚加工過程中產(chǎn)生的廢物，但因其含有豐富的膠原蛋白，已經(jīng)成為潛在的膠原蛋白新的原料資源［2］。綜合利用魚鱗不僅可以減少污染排放，保護生態(tài)環(huán)境，還可以獲得好的經(jīng)濟和社會效益。近年來，從魚鱗和其它魚加工廢棄物(魚皮、魚骨、魚刺、魚內(nèi)臟等)中提取膠原蛋白受到人們極大關(guān)注，并取得了較大的進展［3－9］。從魚鱗中提取膠原蛋白主要有酸法和酶法兩種，較之酸法提取，酶法提取具有水解速度快、提取時間短、提取率高和不產(chǎn)生污染等優(yōu)點。近年來，中國報道的酶法提取魚鱗膠原蛋白的文獻中采用的酶催化劑主要有胃蛋白酶［1，4，10－13］和 alcalase 堿性蛋白酶［14－16］，研究的對象主要是草魚、鯉魚、鰱魚、鯽魚和羅非魚魚鱗等。與胃蛋白酶和alcalase堿性蛋白酶比較，木瓜蛋白酶是一種在堿性、中性和酸性條件下均能分解蛋白質(zhì)的蛋白酶，可在比較溫和的操作條件下工作，但是目前報道用木瓜蛋白酶提取魚鱗膠原蛋白的文獻極少，只有黃煥等［16］報道了木瓜蛋白酶從青魚魚鱗中提取膠原蛋白的工藝研究(以水解度為目標(biāo)值)。鳙魚是中國“四大家魚”之一，其產(chǎn)量隨著人們生活的需要而逐年提高。不同魚種的魚鱗的結(jié)構(gòu)和成分存在一定的差異，因此其提取的工藝條件也會有所不同。但目前尚未發(fā)現(xiàn)其它有關(guān)從鳙魚魚鱗中提取膠原蛋白的文獻報道。本研究擬以鳙魚魚鱗為研究對象，選擇木瓜蛋白酶為催化劑，在pH=6的環(huán)境下從魚鱗中提取膠原蛋白。以膠原蛋白提取率為目標(biāo)值對工藝參數(shù)進行優(yōu)化，并通過紅外光譜的測試，對所提取產(chǎn)品的特征進行分析和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳙魚魚鱗:來源于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場;

L-羥脯氨酸(L-hydroxyproline):BR級，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;

木瓜蛋白酶(Papain):BR級，U≥1 000 U/mg，上海藍季科技發(fā)展有限公司;

鹽酸:AR級，上海安達化工有限公司;

硫酸:AR級，西隴化工股份有限公司;

檸檬酸和氫氧化鈉:AR級，天津大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平:FA2104型，上海雷韻試驗儀器制造有限公司;

超級恒溫器:501型，上海實驗儀器廠有限公司;

可見分光光度計:722S型，上海精密科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫干燥箱:01A-1型，上海市實驗儀器總廠;

傅立葉變換紅外光譜儀:Nicolet 5700型，美國熱電尼高力公司。

1.3 提取方法

1.3.1 魚鱗脫鈣預(yù)處理 首先，用剪刀將一定量的魚鱗剪成碎片，用蒸餾水洗凈，放在烘箱中干燥一定時間后浸入濃度為0.1 mol/L的 Na2CO3溶液中，磁力攪拌6 h(溶液/魚鱗之比為10∶1(V∶m))并重復(fù)3次，用蒸餾水將鱗片洗凈直至洗滌水呈中性，以除去非膠原性蛋白和色素等雜質(zhì)。然后，將上述處理后的鱗片浸于質(zhì)量濃度為10%的檸檬酸溶液中(溶液/魚鱗之比為20∶1(V∶m))，磁力攪拌60 min，此過程中魚鱗所含羥基磷灰石中的鈣離子與檸檬酸生成絡(luò)合物溶于溶液中，達到魚鱗脫鈣的目的。

1.3.2 膠原蛋白提取 每次試驗用1 g魚鱗原料，加5 mL一定質(zhì)量濃度的木瓜蛋白酶。選擇膠原蛋白提取率為目標(biāo)值，液固比、提取時間、酶濃度和提取溫度為主要考察因素，并根據(jù)提取過程的實際要求、初步的試驗摸索以及參考的相關(guān)文獻［15］，設(shè)定各因素的水平值范圍見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Levels of factors for orthogonal test

1.4 膠原蛋白提取率的測定

L-羥脯氨酸是膠原蛋白中的特征氨基酸，通過測定樣品中L-羥脯氨酸的含量估算魚鱗膠原蛋白的提取率。

1.4.1 L-羥脯氨酸標(biāo)準溶液配制和線性回歸方程建立 準確稱取100 mg L-羥脯氨酸標(biāo)準品溶解于盛有0.01 mol/L鹽酸溶液的100 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容。測定時，從中移取10 mL放入另一100 mL的容量瓶中后定容，得到濃度為10 mg/mL的L-羥脯氨酸標(biāo)準液。

分別吸取 1.0，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL 的 L-羥脯氨酸標(biāo)準液放入6個100 mL的容量瓶后定容，并計算出濃度，然后用可見分光光度計測定其吸光度［17］，繪制出L-羥脯氨酸濃度―吸光度標(biāo)準曲線，經(jīng)線性化后得回歸方程:

式中:

y——吸光度;

x——羥脯氨酸濃度，mg/mL。

1.4.2 提取率計算 將提取液移至100 mL容量瓶中后用蒸餾水定容。準確吸取10 mL該溶液并移至錐形瓶中，加入3 mol/L的硫酸溶液30 mL，水解16 h(105℃下)后移至50 mL的容量瓶中定容。準確吸取10 mL溶液移至50 mL容量瓶中，先用NaOH溶液(20%)調(diào)至pH=6.0，然后定容，測吸光度，代入上述回歸方程，求得L-羥脯氨酸濃度，再由式(2)計算以1 g魚鱗為基準的L-羥脯氨酸的提取率η:

式中:

η——L-羥脯氨酸的提取率，%;

c——L-羥脯氨酸濃度，mg/mL;

w——魚鱗質(zhì)量，g。

1.5 紅外光譜分析

從膠原蛋白樣品中取微量烘至絕干(105℃下)，壓制成透明薄片后在傅立葉變換紅外光譜儀4 000～500 cm－1光譜范圍內(nèi)測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗結(jié)果與分析

按六因素五水平正交試驗表設(shè)計進行試驗，并采用正交設(shè)計助手計算機軟件分析處理試驗數(shù)據(jù)，其結(jié)果見表2。

2.1.1 直觀分析 由表2可知，試驗號8、15和19的因素水平組合獲得的提取率非常接近且最大，但考慮到經(jīng)濟成本等因素，水平組合A2B3C4D5應(yīng)為25組試驗中較理想的組合，其對應(yīng)的提取率為9.66%。由表2的極值R的大小順序可知，提取時間對提取率的影響程度最大，其次是溫度、酶濃度和液固比。

2.1.2 因素水平趨勢分析 表2中的k值表示任一因素的某一水平獲得的5次不同提取率的平均值［18］。

由表2中因素液固比和酶濃度的k值可知，在選定的液固比和酶濃度的水平范圍內(nèi)，對應(yīng)于液固比20∶1(V∶m)和酶濃度2.5%均有一k的(最大)極值出現(xiàn)(分別為6.666和6.650)，說明所選定的該兩個因素的水平值范圍是合理和有效的，沒有再作調(diào)整的可能。由因素提取時間和提取溫度的k值可知，在選定的提取時間和提取溫度的水平值范圍內(nèi)，k值均隨提取時間和提取溫度的升高而增大，如果進一步提高提取時間和提取溫度，則可獲得更大的提取率，這就意味著原來選定的提取時間和提取溫度的水平上限值都偏低，有必要進一步提高。但從因素提取時間的k值得知，提取時間超過36 h后，k值隨時間的加長而提高的幅度逐漸變緩，考慮到生產(chǎn)能力和經(jīng)濟效益等因素，對提取時間的上限值不再作調(diào)整，并取36 h為合理值。從因素提取溫度的k值可看出，28℃后，繼續(xù)提高溫度仍可使提取率得到較大幅度的提高，但考慮到膠原蛋白的變性溫度較低(＜30℃)，不宜在高溫下操作，因此，限定溫度上限值為28℃，對其不再作調(diào)整。通過以上分析，根據(jù)各因素水平的k值大小，可得到較為理想的水平組合A3B4C4D5，該水平組合在表2中未出現(xiàn)，于此條件下重復(fù)3次平行試驗，得提取率的平均值為1 1.64%。顯然，與水平組合A2B3C4D5相比，水平組合A3B4C4D5可獲得更高的提取率，因此最終確定其為本試驗的最佳因素水平組合，即液固比20∶1(V∶m)、提取時間3 6 h、木瓜蛋白酶濃度2.5%和提取溫度28℃。

2.1.3 方差分析 采用正交設(shè)計助手計算機軟件對正交試驗進行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表3 正交試驗方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal test

由表3可知，由于4個因素的F值均小于F0.1值，所以4個因素的顯著性均為不顯著，但根據(jù)各因素F值的大小可判斷它們對提取率影響程度的相對大小順序為提取時間、提取溫度、酶濃度和液固比，這與直觀分析的結(jié)果是一致的。

2.2 紅外掃描結(jié)果

圖1 樣品紅外光譜譜圖Figure 1 Infrared spectrum of sample

由圖1可知:3 300 cm－1處有酰胺A帶的—NH和 —OH的伸縮振動峰，說明有H鍵存在于肽鏈之間;2 928 cm－1處有 酰 胺 Ⅱ 帶 的 C—H 伸 縮 振 動 峰;1654 cm－1和1 536 cm－1處分別有酰胺Ⅰ帶的C═O伸縮振動峰和酰胺Ⅱ帶的N—H彎曲振動峰，這是膠原蛋白的特征吸收峰;1 454 cm－1和 1 243 cm－1處分別有—CH2—或—CH3的彎曲振動吸收峰和C—O伸縮振動峰，表明樣品中的 —CH2—基團(或—CH3基團)和C—O基團均未被破壞，三股螺旋結(jié)構(gòu)完整性保持良好。以上分析結(jié)果與標(biāo)準I型膠原蛋白的紅外光譜圖基本吻合［19］。

3 結(jié)論

本試驗采用木瓜蛋白酶成功地從鳙魚魚鱗中提取了膠原蛋白，并獲得了較高的提取率。產(chǎn)品經(jīng)紅外光譜表征基本符合I型膠原蛋白的特征。與酸性(胃蛋白酶)和堿性(alcalase)酶催化劑比較，木瓜蛋白酶可在比較溫和的條件下(p H=6)操作，這更加有利于后期產(chǎn)品的純化和廢液的處理。通過正交試驗的直觀分析和因素水平趨勢分析對初步設(shè)定的各因素水平值進行了優(yōu)化，最終確定的最佳工藝參數(shù)為:液固比20∶1(V∶m)、提取時間 36 h、木瓜蛋白酶濃度2.5%和提取溫度28℃，在此條件下，膠原蛋白提取率高達1 1.64%(提取的膠原蛋白的質(zhì)量占魚鱗原料質(zhì)量的百分數(shù))。下步工作將通過紫外光譜和氨基酸成分測定對產(chǎn)品特征進一步分析和鑒定，并對產(chǎn)品的熱變性溫度、乳化性、吸濕性、保濕性和起泡性等性能進行研究。

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